Stabilire un modello murino per l'inalazione di aria a bassa temperatura estrema del tratto respiratorio

Riepilogo

La stimolazione ambientale fredda è stata implicata nello sviluppo di varie malattie croniche. Pertanto, è fondamentale stabilire modelli animali per la ricerca preclinica. Questo sistema risponde a questa esigenza offrendo un dispositivo che crea un modello di stimolo, soddisfacendo i requisiti per la ricerca di base sui meccanismi patogeni.

Abstract

Attualmente, la costruzione di un modello murino per la stimolazione ambientale fredda impiega piastre a calore freddo e dispositivi di raffreddamento indossabili. Questi metodi possono soddisfare parzialmente i requisiti per lo studio delle risposte e degli effetti regolatori della pelle di topo o dei circuiti neurali alla stimolazione fredda. Numerosi studi clinici hanno dimostrato la correlazione tra l'esposizione ad ambienti a bassa temperatura e lo sviluppo di varie malattie. Recentemente, c'è stata una crescente enfasi sullo scambio continuo di informazioni tra organi e tessuti, fornendo una nuova prospettiva su come affrontare problemi di lunga data all'interno del corpo umano. Tuttavia, le installazioni esistenti non sono in grado di costruire un modello per i topi che inalano aria fredda.

Sebbene posizionare i topi in un ambiente freddo sembri attraente, ha notevoli limitazioni. Mentre i topi inalano aria fredda, anche la loro pelle viene stimolata dall'ambiente freddo, rendendo poco chiaro se i cambiamenti patologici risultanti siano dovuti alla stimolazione polmonare attraverso l'interazione di organi distanti o ai recettori della pelle e alla trasmissione del segnale neurale. Ciò crea una notevole confusione nella ricerca correlata. Questo schema presenta un nuovo approccio per la costruzione di un modello murino per la stimolazione dell'inalazione di aria fredda estrema. Questo dispositivo consente ai topi di inalare gas a temperatura estremamente bassa mentre i loro corpi rimangono a una temperatura normale. Massimizza la simulazione degli effetti stimolanti delle temperature ambientali estreme sui topi e soddisfa le esigenze di ricerca per studiare la relazione tra temperature ambientali estreme e malattie correlate.

Introduzione

Questo metodo fornisce principalmente un modello di stimolazione dell'aria a temperatura estremamente bassa nei topi utilizzando un dispositivo di feedback della temperatura di refrigerazione a semiconduttore non invasivo, standardizzato, stabile e batch. Esperimenti clinici relativi alle basse temperature hanno confermato una stretta relazione con l'incidenza e la prognosi di diverse malattie. Uno studio di serie temporali che ha coinvolto 272 grandi città della Cina ha ottenuto un totale di 1.826.186 casi di morti non accidentali. La relazione tra temperatura e mortalità indica costantemente una curva a forma di J rovesciata, con la fase di alti tassi di mortalità dovuti al freddo significativamente più lunga rispetto ad altre temperature. Ciò suggerisce che l'impatto delle basse temperature sull'ictus e sulle malattie cardiovascolari è illimitato alla fase fredda; C'è un'influenza continua durante un periodo dopo che la fase fredda si è attenuata.

Tra i decessi non accidentali, il 14,33% può essere attribuito a fattori di temperatura ambientale, con il freddo moderato (da -1,4 a 22,8 °C) e il freddo estremo (da -6,4 a -1,4 °C) che rappresentano rispettivamente il 10,49% e l'1,14%. Le cause di morte includono malattie cardiovascolari e cerebrovascolari al 17,48%, malattia coronarica al 18,76%, ictus ischemico al 14,09%, ictus emorragico al 18,10%, malattie dell'apparato respiratorio al 10,57% e broncopneumopatia cronica ostruttiva al 12,57%¹. In Cina, gli studi epidemiologici sull'ictus suggeriscono un chiaro gradiente da nord a sud². Nel clima gelido della Cina nord-orientale, la prevalenza dell'ictus è 2,36 volte superiore rispetto alla regione meridionale³. Ricerche sostanziali hanno confermato l'impatto diretto degli ambienti a bassa temperatura sui tassi di mortalità e sull'incidenza di ictus ^4,5,6. Di conseguenza, le notevoli differenze climatiche e termiche rappresentano un fattore ambientale che non può essere ignorato.

La mancanza di un ragionamento scientifico efficace che spieghi la correlazione tra ambienti a bassa temperatura e aumento dei tassi di ictus e problemi cardiaci rimane un argomento di indagine. Mentre la saggezza convenzionale suggerisce che le basse temperature possono aumentare la pressione sanguigna attraverso l'irritazione della pelle e l'eccitazione simpatica⁷, gli individui in genere adottano misure per isolarsi e mantenere l'equilibrio della temperatura corporea in risposta alle condizioni di freddo. Quando esposti a basse temperature, gli esseri umani moderni si affidano al loro sistema respiratorio invece che alla pelle come meccanismo di difesa primario. Mentre gli indumenti spessi possono proteggere la pelle dal freddo esterno, non possono impedire l'inalazione di aria fredda nelle vie respiratorie, esponendo la trachea e gli alveoli a un'intensa stimolazione del freddo. Gli attuali metodi per la costruzione di modelli animali per la stimolazione a bassa temperatura si dividono principalmente in due aspetti. In primo luogo, numerosi studi si sono concentrati sull'esplorazione della risposta e dei meccanismi di regolazione della pelle del topo alla stimolazione a bassa temperatura. Un metodo consiste nel posizionare i topi su una piastra in grado di controllare le variazioni di temperatura (4-25°C) per studiare i meccanismi di regolazione specifici della regolazione della temperatura corporea e del comportamento di evitamento in risposta agli stimoli freddi ^8,9. Altri studi hanno posizionato dispositivi di raffreddamento sul dorso dei topi per esplorare il ruolo dei circuiti neurali nella regolazione della temperatura corporea¹⁰.

Al contrario, diversi studi hanno collocato i topi in piccole camere con temperature variabili (4-30 °C). La ricerca di Lal e colleghi e Qian et al. ha utilizzato questo metodo per costruire un modello murino di stimolazione del freddo per esplorare i circuiti neurali che regolano il controllo neuroendocrino del comportamento alimentare indotto dal freddo^11,12. Tuttavia, i due metodi menzionati hanno i loro limiti. Innanzitutto, la temperatura più bassa è di 4 °C, che è insufficiente per simulare la stimolazione dell'aria a bassissima temperatura. Questo metodo non può escludere gli effetti regolatori della pelle e dei circuiti neurali sull'ambiente freddo. Come sito primario di scambio d'aria, i polmoni sono anche organi in cui si concentrano i neuroni sensibili al freddo ^13,14. Il ruolo regolatorio dei neuroni sensibili al freddo in varie malattie è stato confermato anche da diversi ricercatori 15,16,17. Di conseguenza, è urgentemente necessario un metodo per costruire in modo stabile, massiccio e normativo un modello animale a bassa temperatura del tratto respiratorio. Comprendere il ruolo regolatorio dei polmoni e dei neuroni sensibili al freddo in varie malattie croniche sotto stimolazione dell'aria a bassissima temperatura è essenziale per fornire una base teorica per la prevenzione e il trattamento dell'ictus, della malattia coronarica e delle malattie del sistema respiratorio nelle regioni fredde. Il nostro team ha affrontato questa lacuna critica costruendo un dispositivo a bassa temperatura negli ultimi due anni. Questo dispositivo è caratterizzato da ripetibilità, praticità, struttura semplice e basso costo, che lo rendono adatto a tali studi.

Protocollo

Il Comitato Etico per gli Animali Sperimentali ha approvato tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali presso il Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina di Harbin.

1. Assemblaggio del dispositivo

NOTA: Vedere la Figura 1 per i componenti del dispositivo.

1. Utilizzare connettori metallici per fissare due serie di gusci in ottone a due serie di chip di raffreddamento a semiconduttore. Applicare grasso siliconico termicamente conduttivo tra il guscio in ottone e il chip di raffreddamento del semiconduttore.
2. Applicare grasso termico tra il guscio in ottone e il chip di raffreddamento del semiconduttore.
3. Collegare due gruppi di ventole in ogni pezzo di refrigerazione a semiconduttore sottostante. Assicurarsi che il guscio in ottone, la ventola, il chip di raffreddamento del semiconduttore e il grasso siliconico termicamente conduttivo siano collegati saldamente come unità completa.
4. Posizionare il dispositivo nel suo insieme nella caraffa di raccolta del gas e nelle due piastre di copertura delle fessure.
5. Installare le piastre sopra e sotto la caraffa di raccolta del gas.
6. Collegare il tubo di ingresso dell'acqua e i tubi di uscita dell'acqua rispettivamente all'ingresso e all'uscita dell'acqua del guscio in ottone.
7. Collegare quattro gruppi di gusci di ottone alla parte superiore e inferiore della giara di raccolta del gas con i tubi.
8. Collegare la pompa dell'acqua al tubo di ingresso dell'acqua.
9. Posizionare il tubo di uscita dell'acqua nella cisterna.
10. Collegare quattro set di refrigeratori a semiconduttore e pompe dell'acqua a due set di alimentatori (12 V e 40 A).

2. Preparazione dell'animale per l'esperimento

NOTA: Per questi esperimenti abbiamo utilizzato un topo maschio C57Bl/6 di 4 settimane. Si raccomanda di lasciare che il topo si adatti al fissatore per 3-5 giorni prima della preparazione del modello. L'ambiente sperimentale deve essere a temperatura ambiente e mantenuto silenzioso per evitare rumori durante l'intero esperimento.

1. Fissare il mouse nel fissatore: posizionare il mouse nel fissatore, posizionando la parte anteriore del naso del mouse all'apertura del fissatore. Utilizzare un tappo di spugna adatto per riempire e fissare la parte posteriore del fissatore, assicurandosi che abbia fori di ventilazione. Quindi, posizionare il fissatore per topi nella fessura cilindrica della giara di raccolta del gas (Figura 1D).

3. Flusso operativo sperimentale

1. Prepara una miscela di acqua ghiacciata e mettila nella cisterna.
   NOTA: Per questo passaggio, assicurarsi che il livello dell'acqua della miscela ghiaccio-acqua sia superiore alla pompa per garantire che la miscela venga aggiunta in tempo durante l'esperimento. Si sconsiglia l'uso di acqua a temperatura ambiente
2. Posizionare la pompa dell'acqua all'interno della miscela di acqua ghiacciata e assicurarsi che il tubo di uscita sia sommerso.
3. Posizionare la sonda del sensore di temperatura all'interno del foro di misurazione della temperatura della caraffa di raccolta del gas.
4. Collegare la pompa dell'acqua alla sua fonte di alimentazione e accenderla.
5. Collegare l'alimentatore al termoregolatore, collegare l'adattatore di alimentazione dell'unità di refrigerazione alla presa di corrente del termoregolatore e impostare l'intervallo di temperatura desiderato sul regolatore.
6. Impostare l'intervallo di temperatura del termoregolatore.
7. Dopo l'esperimento, rimuovere il mouse e riposizionarlo nel suo ambiente di alloggiamento.
8. Togliere l'alimentazione al termoregolatore.
9. Spegnere la pompa dell'acqua.

4. Imaging termico

NOTA: Per dimostrare e verificare che i topi possono inalare aria a temperatura estremamente bassa mantenendo la normale temperatura corporea all'interno di questo apparato, la temperatura nel barattolo di raccolta del gas è stata misurata utilizzando una termocamera (Figura 2).

1. Utilizzare una termocamera portatile per accertare le temperature sia del foro dell'aria che del foro di misurazione della temperatura della vaschetta di raccolta del gas da una distanza ottimale.
2. Posizionare il punto laser rosso, che indica la posizione di misurazione, esattamente al centro dell'area di misurazione della temperatura designata.
3. Utilizzando la stessa metodologia, rimisurare la temperatura corporea dei topi.

Risultati

Possiamo osservare la costruzione complessiva di questo dispositivo, che include un chip di refrigerazione a semiconduttore, grasso siliconico termicamente conduttivo, un barattolo di raccolta del gas, un regolatore di temperatura, un ventilatore, un sistema di circolazione del raffreddamento ad acqua, un fissatore per mouse e un alimentatore. Una singola unità può soddisfare contemporaneamente le esigenze di modellazione di un massimo di 16 mouse (Figura 1A

Discussione

Nella costruzione di un modello di stimolazione a bassa temperatura, sono necessari diversi passaggi chiave e precauzioni per garantire l'accuratezza dell'esperimento e il benessere degli animali. Utilizzare una miscela di acqua ghiacciata invece di acqua a temperatura ambiente per mantenere uno stato di bassa temperatura dell'acqua di raffreddamento durante l'esperimento, il che aiuta a simulare ambienti a temperatura estremamente bassa. Assicurarsi che il sistema di ricircolo dell'acqu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
brass shell	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company
cistern	Shenzhen Gongdecheng plastic industry
fan	ChaoJingYin electoronic.,LTD	4010	12 V
Gas collection jar	Shenzhen Gongdecheng plastic industry
intake/outlet pipe	Shanghai Shenchen rubber and plastic products factory
mouse fixator	Lanjieke technology
power	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company		12 V 40 A
Semiconductor cooling chip	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company	TEC2-19006	Double layer refrigeration
Sponge plug	Shenzhen Gongdecheng plastic industry
Stainless steel fastener	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company
thermally conductive silicone grease	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company	DRG102
water pump	Shenzhen Jutai pump Co.,LTD	DC005	12 V
Water pump power adapter	Chaoke power adapter factory	1210	100-240 V 50-60 HZ 12 V