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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe un método de análisis integral de citometría de masas (citometría por tiempo de vuelo [CyTOF]) para evaluar las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en el carcinoma hepatocelular (CHC). El enfoque tiene como objetivo proporcionar información sobre el panorama inmunitario del CHC, ofreciendo una comprensión más profunda del microambiente tumoral y los mecanismos inmunitarios asociados.

Resumen

El carcinoma hepatocelular (CHC) es una de las formas más comunes y mortales de cáncer de hígado en todo el mundo. A pesar de los avances en el tratamiento, el pronóstico para los pacientes con CHC sigue siendo precario debido a la compleja interacción de factores genéticos, ambientales e inmunológicos que impulsan su progresión. Comprender el panorama inmunitario del CHC es crucial para desarrollar terapias eficaces, especialmente en el campo de la inmunoterapia, que es muy prometedora para mejorar los resultados de los pacientes. En este estudio se emplea la tecnología de citometría masiva (citometría por tiempo de vuelo [CyTOF]) para investigar las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en pacientes con CHC. Mediante el análisis de muestras de sangre periférica y tumores, la investigación tiene como objetivo identificar poblaciones únicas de células inmunitarias y sus estados funcionales asociados con la progresión del CHC. Los hallazgos proporcionan una visión completa del panorama inmunitario en el CHC, destacando los posibles biomarcadores y dianas terapéuticas. Este enfoque ofrece información valiosa sobre los mecanismos inmunitarios subyacentes al CHC y allana el camino para el desarrollo de inmunoterapias más eficaces para esta neoplasia maligna.

Introducción

El carcinoma hepatocelular (CHC) es el cáncer primario de hígado más común y un importante problema de salud mundial debido a sus altas tasas de incidencia y mortalidad1. Según la Organización Mundial de la Salud, el CHC es el quinto cáncer más común y la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo2. Es particularmente prevalente en regiones con altas tasas de infecciones crónicas por hepatitis B y C, como Asia Oriental y África Subsahariana3. Los principales factores de riesgo incluyen hepatitis viral, cirrosis y síndrome metabólico4. El CHC requiere un tratamiento a largo plazo, lo que impone cargas físicas y financieras sustanciales, lo que subraya la necesidad de una prevención eficaz, una detección precoz y estrategias de tratamiento innovadoras5.

El sistema inmunitario desempeña un papel crucial en el desarrollo del CHC. El hígado es un órgano inmunológicamente activo con una gran cantidad de células inmunitarias, incluidos los macrófagos residentes en el hígado, las células asesinas naturales (NK) y las células T, que son esenciales para monitorear y eliminar las células anormales6. Sin embargo, el CHC puede evadir la vigilancia inmunitaria mediante la expresión de moléculas inmunosupresoras, el reclutamiento de células inmunosupresoras y la alteración del microambiente tumoral 7,8. Este escape inmune no solo promueve el crecimiento tumoral y la metástasis, sino que también afecta la respuesta a la inmunoterapia 9,10.

Las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en el microambiente tumoral son factores clave que influyen en la progresión del cáncer y los resultados terapéuticos. Las respuestas inmunitarias sistémicas involucran células inmunitarias circulantes que pueden reconocer y atacar a las células tumorales distantes, como las células T periféricas, las células NK y los monocitos que pueden atacar las células tumorales de todo el cuerpo. Las respuestas inmunitarias locales se centran en la actividad de las células inmunitarias dentro del microambiente tumoral, incluidos los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL), los macrófagos asociados al tumor (TAM) y las células T reguladoras (Treg). Mientras que los TIL a menudo ejercen efectos citotóxicos contra las células tumorales, los TAM y las Tregs suelen contribuir a un entorno inmunosupresor que favorece el crecimientotumoral 11,12. Las células tumorales y las células estromales pueden remodelar el microambiente tumoral para promover la inmunosupresión y evadir la vigilancia inmunitaria. La interacción entre las respuestas inmunitarias sistémicas y locales determina la eficacia global de la inmunidad antitumoral11. Comprender esta interacción puede ayudar a desarrollar estrategias de inmunoterapia más efectivas.

La citometría de flujo y la inmunohistoquímica tradicionales, aunque se utilizan ampliamente en estudios inmunológicos, presentan limitaciones significativas cuando se trata de analizar paisajes inmunitarios complejos debido a su incapacidad para realizar análisis exhaustivos y de alta dimensión. La citometría de flujo es muy eficaz para detectar marcadores de superficie y funcionales a nivel de una sola célula; Sin embargo, su capacidad para el análisis simultáneo de múltiples marcadores es limitada, a menudo limitada por la superposición espectral y las restricciones prácticas en el número de etiquetas fluorescentes que se pueden utilizar13,14. La inmunohistoquímica, por otro lado, proporciona información valiosa sobre el contexto tisular de marcadores específicos, pero se ve obstaculizada de manera similar por el número limitado de marcadores analizables y las dificultades inherentes para lograr evaluaciones sólidas, cuantitativas y de alta dimensión15.

Para caracterizar eficazmente los entornos inmunitarios complejos, son esenciales las técnicas de alta dimensión como la citometría de masas (citometría por tiempo de vuelo [CyTOF]). La citometría de masas es una tecnología avanzada que emplea la espectrometría de masas para analizar múltiples marcadores de proteínas en células individuales. Permite el análisis multiparamétrico de células individuales sin los problemas de superposición espectral que se observan en la citometría de flujo tradicional16. Mediante el uso de anticuerpos marcados con metal, puede medir docenas de marcadores simultáneamente, ofreciendo una visión completa e imparcial de los fenotipos y funciones celulares17. Por ejemplo, Gadalla et al. desarrollaron un panel CyTOF con más de 40 parámetros para el análisis de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y tejido tumoral, demostrando su ventaja en el inmunofenotipado de alta dimensión18. La citometría de flujo tradicional, con su número limitado de parámetros detectables, no pudo identificar estas poblaciones celulares raras que exhibían fenotipos únicos. Por el contrario, la citometría de masas permitió una evaluación exhaustiva de los estados funcionales de estas células, proporcionando una caracterización más detallada y robusta. Behbehani et al. utilizaron la citometría masiva para analizar muestras de médula ósea de pacientes con síndromes mielodisplásicos (SMD), identificando y caracterizando con éxito células progenitoras hematopoyéticas aberrantes raras18. La capacidad de la citometría de masas para detectar simultáneamente más de 40 marcadores de superficie e intracelulares mejoró significativamente la detección de estos subconjuntos de células de baja frecuencia19. Estas capacidades superan las limitaciones tradicionales y proporcionan una visión más profunda del panorama inmunitario, lo que impulsa el progreso en inmunología y desarrollo terapéutico. La capacidad de perfilar de forma exhaustiva los fenotipos y las funciones celulares a nivel de una sola célula avanza en gran medida en la comprensión de los procesos inmunológicos y ayuda en el desarrollo de terapias dirigidas.

La citometría de masas proporciona información completa sobre las poblaciones de células inmunitarias sistémicas y locales en el CHC mediante la detección simultánea de múltiples marcadores proteicos. Esta tecnología puede distinguir entre varios tipos de células T dentro del microambiente tumoral, como las células T efectoras, las células T reguladoras (Tregs) y las células T agotadas, dilucidando sus funciones específicas en la progresión tumoral. Mediante el uso de la citometría de masas, los investigadores pueden identificar marcadores inmunitarios asociados con el pronóstico del CHC20. Por ejemplo, los subconjuntos de linfocitos T con alta expresión de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) pueden servir como predictores de la respuesta de un paciente a los inhibidores de puntos de control inmunitario21. Además, facilita el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas mediante la identificación de moléculas inmunosupresoras específicas, proporcionando así una base para estrategias de tratamiento personalizadas. La capacidad de la tecnología para detectar múltiples marcadores y su resolución de una sola célula la hacen particularmente ventajosa para descubrir nuevas dianas terapéuticas y diseñar inmunoterapias combinadas. Este enfoque avanzado tiene un potencial significativo para mejorar los resultados del tratamiento en pacientes con CHC, ya que ofrece una comprensión detallada del panorama inmunitario y permite el desarrollo de intervenciones terapéuticas personalizadas.

Este estudio tiene como objetivo utilizar la citometría de masas para analizar los perfiles de células inmunitarias sistémicas y locales de pacientes con CHC. Los objetivos son caracterizar las poblaciones de células inmunitarias, correlacionar estas características con los resultados clínicos y las respuestas terapéuticas, e identificar marcadores inmunitarios específicos y subconjuntos celulares asociados con el pronóstico del CHC. Al dilucidar el papel de varias células inmunitarias en las respuestas al tratamiento, este estudio busca proporcionar una base para estrategias de tratamiento personalizadas. Se espera que los hallazgos optimicen las inmunoterapias existentes y ofrezcan información valiosa para el desarrollo de nuevos tratamientos, con el objetivo final de mejorar la supervivencia general y la calidad de vida de los pacientes con CHC.

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Protocolo

En el siguiente plan se describen los pasos para la recolección de muestras de sangre y CHC, el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), la disociación de células individuales y la tinción. Los reactivos y materiales experimentales se enumeran en la Tabla de Materiales. Todos los experimentos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, asegurando que la recolección de muestras tumorales no interfiriera con el diagnóstico patológico. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos humanos.

1. Aislamiento de las PBMC

  1. Extraiga una muestra de sangre de la vena de los pacientes con CHC y use un tubo lleno de un anticoagulante para evitar que la sangre se coagule. Se obtuvieron muestras de sangre de 4 pacientes (2 hombres y 2 mujeres) con edades comprendidas entre los 50 y los 60 años, con una edad media de 55 años. Para cada paciente, recoja de 10 a 20 ml de sangre periférica para garantizar un volumen suficiente para el aislamiento posterior de las PBMC y minimizar las molestias del paciente.
  2. Extraiga un volumen específico de sangre (por ejemplo, 6 mL) y agregue un volumen igual de líquido de separación de linfocitos de sangre periférica (Ficol-paque o Lymphoprep) a un tubo de centrífuga de 15 mL.
    NOTA: Lo ideal es que el volumen total no supere los 12 ml para dejar espacio para una mezcla adecuada y evitar el desbordamiento; el volumen máximo recomendado para un tubo de centrífuga de 15 mL es de 14 mL.
  3. Incline el tubo de centrífuga a 45 ° y agregue lentamente la sangre a lo largo de la pared del tubo, colocando con cuidado la sangre lentamente sobre el líquido de separación de linfocitos de sangre periférica para evitar mezclar las dos capas.
    NOTA: Se puede usar una pipeta para agregar sangre lentamente a lo largo de la pared del tubo.
  4. Coloque el tubo de centrífuga en la centrífuga y ajuste la aceleración a 8 y la desaceleración a 3. Centrifugar a 450 x g, 4 °C, durante 30 min. Después de la centrifugación, se forman 4 capas en el tubo de ensayo, de arriba a abajo: capa de plasma, capa de PBMCs (capa de membrana blanca), capa de Ficol-Paque y capa de glóbulos rojos y granulocitos.
  5. Con una pipeta, recoja cuidadosamente la capa de PBMC en un nuevo tubo de centrífuga estéril. Añadir 3 veces el volumen de PBS y centrifugar a 500 x g a 4°C durante 5 min. Después de la centrifugación, se forma un pellet en el fondo del tubo.
  6. Deseche el sobrenadante con una pipeta, agregue 1 mL de solución salina tamponada con suero bovino fetal y fosfato al 2% (FBS-PBS) para resuspender las células y luego agregue 3 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC). Centrifugar a 500 x g a 4°C durante 5 min.
  7. Asegúrese de que no haya glóbulos rojos en el fondo del tubo, lo que indica que los glóbulos rojos se han lisado por completo. Vuelva a suspender las células en FBS-PBS al 2% y proceda directamente con los experimentos posteriores, o agregue la solución de criopreservación celular y almacene a -80 ° C durante 2-3 meses.
    NOTA: Como pauta general, para la resuspensión, use 0.5 mL de FBS-PBS al 2% por 1 x 106 celdas. El recuento de células se determina utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado después de la tinción con azul de tripán para distinguir las células vivas de las células muertas. Esta relación ayuda a garantizar una recuperación celular óptima y la viabilidad durante los procedimientos posteriores.

2. Aislamiento de células de tejido tumoral

NOTA: El método para el aislamiento de células de tejido tumoral fue adaptado de Song et al.22.

  1. Después de resecar el CHC, guiado por un patólogo, se usa un bisturí estéril para extirpar una parte del tejido tumoral. El bloque de tejido debe tener un tamaño aproximado de 1 cm3 . Enjuague cualquier mancha superficial con 1x PBS preenfriado. Sumerja el tejido en un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga aproximadamente 5 mL de medio RPMI 1640 que contenga 10% de FBS. Coloque el tubo en hielo y transpórtelo de regreso al laboratorio para su posterior procesamiento.
  2. Enjuague bien las manchas de sangre y elimine manualmente el tejido conectivo graso con pinzas para garantizar una limpieza completa del tejido con FBS-PBS preenfriado al 2%. Transfiera el tejido a una placa tratada con cultivo de tejidos que contenga una solución de digestión. Asegure el tejido tumoral con pinzas y córtelo en pedazos de menos de 1mm3 con un bisturí. Transfiera la solución de digestión de tejidos a un tubo centrífugo de 50 ml, agregando más solución de digestión de tejidos hasta que el volumen total sea de aproximadamente 15 ml.
  3. Coloque el tubo de centrífuga que contiene la mezcla de digestión de tejidos en un agitador. Inclínalo o aplánalo y asegúralo para la digestión a 150 rpm y 37 °C durante 1 h. Filtrar la solución de digestión a través de un filtro de 70 μm.
    1. Durante este procedimiento, use un émbolo de jeringa de 1 ml para moler los fragmentos de tejido. Enjuague el filtro con una solución FBS-1640 al 2%. Tome el filtrado y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 mL.
  4. Centrifugar el filtrado a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender con cuidado el pellet en aproximadamente 10 ml de solución de Percoll al 36%. A continuación, vuelva a centrifugarlo a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
  5. Aspire suavemente 1 ml de tampón de lisis de RBC con una pipeta para resuspender la suspensión celular. Transfiera la suspensión a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mL y agregue el tampón de lisis RBC para alcanzar un volumen total de 10 mL. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    NOTA: Se utiliza un nuevo tubo de centrífuga para evitar que las impurezas de la pared del tubo vuelvan a entrar en la suspensión celular, reduciendo así el riesgo de disminución del rendimiento celular.
  6. Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min a 4 °C, luego resuspender las celdas en un volumen apropiado de 2% FBS-PBS. Como pauta general, use 0.5 mL de FBS-PBS al 2% por 1 x 106 celdas para la resuspensión.
    NOTA: El recuento de células se determina mediante el uso de un hemocitómetro o un contador de células automatizado después de la tinción con azul de tripán para distinguir las células vivas de las células muertas. El volumen de resuspensión depende de la cantidad de celda requerida para experimentos posteriores. Esta relación ayuda a garantizar una recuperación celular óptima y la viabilidad durante los procedimientos posteriores.

3. Tinción de cisplatino

  1. Tome 3 x 106 células de las PBMC obtenidas en el paso 1.7 y las células tumorales aisladas en el paso 2.6, respectivamente. Después de la recuperación celular, resuspenderlas en 1 mL de PBS sin Ca2+ y Mg2+. Agregue cisplatino hasta una concentración final de 0,5 μM, mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 2 minutos.
    NOTA: La tinción con cisplatino se realiza para distinguir las células muertas de las células vivas en función de la integridad de la membrana. Las células muertas con membranas comprometidas absorberán cisplatino y mostrarán una señal positiva, mientras que las células vivas permanecerán sin teñir23. El número de celdas debe ser al menos 1 x 106.
  2. Centrifugar los tubos a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y, a continuación, añadir 1 mL de tampón de tinción celular a cada tubo que contenga las suspensiones celulares preparadas en el paso 3.1 para detener la reacción. Centrifugar a 500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y asegurarse de que el pellet de la celda no se distribuya linealmente a lo largo de la pared del tubo después de la centrifugación.

4. Bloqueo del receptor Fc

  1. Prepare una mezcla de bloques de 50 μL con antelación para cada muestra: Combine 48 μL de tampón de tinción celular, luego agregue 2 μL de solución de bloqueo de Fc (tampón de tinción celular: solución de bloqueo de Fc = 9:1).
  2. Suspenda las celdas del paso 3.2 en la mezcla anterior y déjelas reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

5. Incubación de anticuerpos contra proteínas de membrana

  1. Para cada muestra de célula obtenida en el paso 4.2, prepare la mezcla de anticuerpos de proteínas de membrana añadiendo 1,1 μL de unidades de cada anticuerpo. A continuación, añada un tampón de tinción celular para alcanzar un volumen final de 55 μL. En este punto, el volumen total es de aproximadamente 100 μL.
    NOTA: La mezcla incluye anticuerpos dirigidos a proteínas clave de membrana, como CD163, CCR3, CD141, CD117 y CD4524,25. Estos anticuerpos se seleccionaron por su especificidad en la identificación de marcadores de proteínas de membrana y se obtuvieron de fuentes disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles, incluidos los números de clones, los fabricantes y los números de catálogo).
  2. Agregue 50 μL de mezcla de anticuerpos preparada a cada muestra de tubo, lleve el volumen total a 100 μL. Agite suavemente las muestras e incube a temperatura ambiente durante 15 min.
  3. Agregue 2 mL de tampón de tinción celular a cada muestra, centrifugue a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Repita este paso 2 veces.
  4. Deseche el sobrenadante y haga un vórtice breve con el líquido restante con el pellet de la célula para resuspender y dispersar completamente la célula.

6. Tinción de proteínas del núcleo

  1. Una vez que las células se hayan resuspendido completamente, añadir 500 μL de la solución mezclada (fijación: fijación/permeabilización = 3:1) a cada muestra del paso 5.4. Mezcle suavemente las muestras e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  2. Diluir el tampón de permeabilización (10x) con agua desionizada. Después de la incubación, centrifugar a 500 g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Añadir 1000 μL de tampón de permeabilización 1x a cada tubo para lavar las células. Centrifugar a temperatura ambiente a 1.000 x g durante 5 min, luego desechar el sobrenadante.
  3. Resuspender anticuerpos en tampón de permeabilización 1x. Deseche el sobrenadante y agregue 50 μL de la mezcla de anticuerpos a cada tubo de células. Pipetear suavemente las células para mezclar, luego incubar a temperatura ambiente durante 30-45 min.
  4. Añadir 1000 μL de tampón de permeabilización 1x a cada tubo, centrifugar a temperatura ambiente a 1.000 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
  5. Añadir 1000 μL de tampón de tinción celular a cada tubo para volver a suspender las células, centrifugar a temperatura ambiente a 1.000 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.

7. Fijación celular

  1. Prepare una solución de formaldehído al 1,6% en PBS, con 1 mL necesario por muestra.
  2. Agregue 1 mL de solución de formaldehído al 1.6% a cada muestra del paso 6.5, vórtice para mezclar bien e incube a temperatura ambiente durante 10 min.
    NOTA: Si bien el formaldehído se usa comúnmente para la fijación celular, también se pueden usar reactivos alternativos como el paraformaldehído (PFA) al 4% o el metanol. La elección del fijador debe basarse en los requisitos específicos del experimento y en las características celulares que se van a observar.
  3. Centrifugar a temperatura ambiente a 800 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.

8. Tinción de intercalación nuclear

  1. Prepare la solución de intercalación celular: Diluya Cell-ID Intercalator-Iridium (Ir) con Fix y tampón de permeabilización hasta una concentración final de 125 nM. Prepare 1 mL de la solución por muestra.
  2. Añadir 1 mL de la solución de intercalación celular preparada a cada muestra fija del paso 7.3. Mezcle suavemente y en vórtice inmediatamente. Esto ayuda a minimizar la formación de agregados celulares.
  3. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h o a 4 °C durante la noche. Centrifugar a 500 g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.

9. Preparación de la suspensión celular

  1. Añadir 1000 μL de tampón de tinción celular al tubo desde el paso 8.3 y centrifugar a 800 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Repita este paso 2 veces.
  2. Añadir 450 μL a 900 μL de agua desionizada para resuspender las células. Cuente las células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado después de la tinción con azul de tripano. Después del recuento, proceda con la recopilación y el análisis de datos mediante citometría de masas.

10. Citometría de masas y análisis de datos

  1. Adquiera datos de citometría de masas utilizando un sistema CyTOF y guárdelos como archivos de citometría de flujo estándar (FCS). Garantice la calibración adecuada del instrumento y el control de calidad para reducir el ruido de fondo y los efectos de lote según las instrucciones del fabricante.
  2. Preprocese la población de células CD45+ en el archivo FCS utilizando el software asociado. Elimine los residuos en función del tamaño de la celda (dispersión directa, FSC) y la granularidad (dispersión lateral, SSC). Excluya los dobletes por compuerta secuencial de las parcelas FSC-A/FSC-H o SSC-A/SSC-H. Elimine las células muertas mediante la tinción de viabilidad, como la exclusión de cisplatino. Controlar la población CD45+ para centrarse en las células inmunitarias y exportar la población controlada para su posterior análisis.
  3. Transforme los datos con un cofactor de 5 e identifique los principales clústeres utilizando el software de agrupación. Realice la agrupación en clústeres basada en el algoritmo SPADE, análisis de progresión de eventos normalizados por densidad (SPADE), que agrupa las celdas con perfiles de expresión de marcadores similares en grupos26. Utilice la incrustación de vecinos estocásticos jerárquicos (HSNE) para la reducción de la dimensionalidad y la identificación de grupos distintos26.
  4. Realice la reagrupación de los clústeres principales utilizando el paquete cytofkit en el software R para la agrupación en clústeres no supervisada. Identifique los subclústeres con PhenoGraph utilizando los parámetros predeterminados.
  5. Aplique la aproximación y proyección uniforme de la variedad (UMAP) para la reducción de la dimensionalidad. Realizar análisis estadísticos mediante la prueba de Wilcoxon, considerando como estadísticamente significativo un valor de P < 0,05. Visualiza los resultados usando ggplot2.

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Resultados

Para dilucidar las características inmunológicas asociadas con el CHC, se realizó un análisis exhaustivo de las poblaciones de células inmunitarias. Se recolectaron muestras pareadas de PBMC y tejido de CHC de 4 pacientes con CHC. Se realizó un perfil de citometría masiva para examinar las poblaciones de células inmunitarias a nivel proteómico de una sola célula, utilizando dos paneles de anticuerpos para muestras de tejido de PBMC y CHC.

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Discusión

Este estudio aprovecha la tecnología de citometría masiva para proporcionar un análisis en profundidad de las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en el CHC. La aplicación de la citometría de masas en este contexto permite la detección simultánea de múltiples marcadores a nivel de una sola célula, lo que ofrece una caracterización inmunofenotípica detallada que es crucial para comprender el complejo panorama inmunitario del CHC. La citometría de masas ha revolucionad...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (subvención 2019YFA0803000 a J.S.), la Fundación Juvenil Excelente de Zhejiang Scientific (subvención R22H1610037 a J.S.), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención 82173078 a J.S.), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (subvención 2022C03037 a J.S.).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1×PBSHyCloneSH30256.01
10×PBSHyCloneSH30256.01
100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dishCorning430167
1000 mL pipette tipsRainin30389218
15 mL centrifuge tubeNEST601052
200 mL pipette tipsRainin30389241
40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainerFalcon352340
50 mL centrifuge tubeNEST602052
70 μm syringe fifilterSangon BiotechF613462-9001
Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)BioLegend357224
Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)BioLegend310724
Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)BioLegend353240
Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)BioLegend350202
Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)BioLegend347314
Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)BioLegend313201
Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) BD562721
Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) BD563026
Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)BioLegend306002
Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)BioLegend351337
Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)BioLegend301701
Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)BioLegend356535
Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)BioLegend325604
Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)BioLegend344102
Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)BioLegend376302
Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) BD561313
Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)BioLegend339902
Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)BioLegend333603
Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)BioLegend346002
Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)BioLegend302226
Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)BioLegend331501
Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)BioLegend302301
Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)BioLegend321151
Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)BioLegend311129
Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)BioLegend302624
Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) BD555916
Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)BioLegend375902
Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)BioLegend303232
Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)BioLegend369812
Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)BioLegend303402
Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) BD563094
Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) BD563716
Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)BioLegend304220
Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)BioLegend362510
Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)BioLegend399502
Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)BioLegend392917
Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)BioLegend333808
Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)BioLegend310902
Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)BioLegend395602
Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) BD557750
Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)BioLegend375402
Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)BioLegend374202
Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)BioLegend320101
Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)BioLegend311426
Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)BioLegend307650
Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)BioLegend348211
Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)BioLegend350501
Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)BD567783
Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)BioLegend329951
Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)BioLegend393602
Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) BD740415
Cell cryopreservation solutionThermo FisherA2644601
Cell-lD CisplatinStandard BioTools201064
Cell-lD Intercalator-lrStandard BioTools201192A
Collagenase, Type IVGibco17104019
Constant-temperature shakeFAITHFULFS-50B
CyTOF SystemFluidigm CorporationHelios
CytosploreCytosplore Consortium2.3.1
Dispase IIGibco17105041
DNase IMerckDN25
Eppendorf centrifugeEppendorf5702
EQ Four Element Calibration BeadsStandard BioTools201078
FBSGibco16000-044
Ficoll-paqueCytiva17-1440-02
FinnpipetteThermo Scientific4700870
Fixation bufferThermo ScientificFB001
FlowJoBD Life Sciences10.1
Formaldehyde solutionThermo Scientific28906
Granzyme B Antibody, anti-human/mouse (clone: QA16A02)BioLegend396413
Heparin TubesBD367874
Human BD Fc Block 2.5 mg/mLBD564220
MACS Tissue Storage SolutionMiltenyi130-100-008
Maxpar Fix and Perm BufferStandard BioTools201067
Maxpar metal-coniugated antibodiesStandard BioToolsVarious
Maxpar PBSStandard BioTools201058
Maxpar WaterStandard BioTools201069
Maxpare Cell Staining BufferStandard BioTools201068
Metal-conjugated Anti-Human α-SMA Antibody (clone: 1A4)Miltenyi Biotec130-098-145
PercollMerckP4937-500ML
Permeabilization bufferThermo Scientific00833356
RBC lysis bufferBD555899
Refrigerated centrifugeEppendorf5910ri
RPMI 1640 medium GE HealthCareSH30027.0
ScalpelAPPLYGENTB6298-1
Sterile Pasteur pipetteZDANZD-H03
Tissue digestion solutionYeasen Biotech41423ES30
Tuning SolutionStandard BioTools201072
Vortex MixerThermo Scientific88882012

Referencias

  1. Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia. Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).
  2. Renne, S. L., et al. Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview. Pathologica. 113 (3), 203-217 (2021).
  3. Sayiner, M., Golabi, P., Younossi, Z. M. Disease burden of hepatocellular carcinoma: A global perspective. Dig Dis Sci. 64 (4), 910-917 (2019).
  4. Zhang, X., et al. Risk factors and prevention of viral hepatitis-related hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 11, 686962(2021).
  5. Zou, H., et al. Economic burden and quality of life of hepatocellular carcinoma in greater China: A systematic review. Front Public Health. 10, 801981(2022).
  6. Li, Y., You, Z., Tang, R., Ma, X. Tissue-resident memory t cells in chronic liver diseases: Phenotype, development and function. Front Immunol. 13, 967055(2022).
  7. Shen, K. Y., Zhu, Y., Xie, S. Z., Qin, L. X. Immunosuppressive tumor microenvironment and immunotherapy of hepatocellular carcinoma: Current status and prospectives. J Hematol Oncol. 17 (1), 25(2024).
  8. Oura, K., Morishita, A., Tani, J., Masaki, T. Tumor immune microenvironment and immunosuppressive therapy in hepatocellular carcinoma: A review. Int J Mol Sci. 22 (11), 5801(2021).
  9. Chen, Y., et al. Effect of infiltrating immune cells in tumor microenvironment on metastasis of hepatocellular carcinoma. Cell Oncol. 46 (6), 1595-1604 (2023).
  10. Du, Q., An, Q., Zhang, J., Liu, C., Hu, Q. Unravelling immune microenvironment features underlying tumor progression in the single-cell era. Cancer Cell Int. 24 (1), 143(2024).
  11. Xu, L., et al. Reshaping the systemic tumor immune environment (stie) and tumor immune microenvironment (time) to enhance immunotherapy efficacy in solid tumors. J Hematol Oncol. 15 (1), 87(2022).
  12. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 131(2021).
  13. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: Visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  14. Sahaf, B., Rahman, A., Maecker, H. T., Bendall, S. C. Biomarkers for immunotherapy of cancer: Methods and protocols. , Springer. New York, New York, NY. (2020).
  15. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8 (6), e68519(2013).
  16. Wu, K., et al. Redefining tumor-associated macrophage subpopulations and functions in the tumor microenvironment. Front Immunol. 11, 1731(2020).
  17. Elaldi, R., et al. High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture. Front Immunol. 12, 666233(2021).
  18. Gadalla, R., et al. Validation of cytof against flow cytometry for immunological studies and monitoring of human cancer clinical trials. Front Oncol. 9, 415(2019).
  19. Ijsselsteijn, M. E., Van Der Breggen, R., Farina Sarasqueta, A., Koning, F., De Miranda, N. A 40-marker panel for high dimensional characterization of cancer immune microenvironments by imaging mass cytometry. Front Immunol. 10, 2534(2019).
  20. Zhang, Q., et al. Mass cytometry-based peripheral blood analysis as a novel tool for early detection of solid tumours: A multicentre study. Gut. 72 (5), 996-1006 (2023).
  21. Zheng, B., et al. Trajectory and functional analysis of pd-1(high) cd4(+)cd8(+) t cells in hepatocellular carcinoma by single-cell cytometry and transcriptome sequencing. Adv Sci. 7 (13), 2000224(2020).
  22. Song, J., et al. Protocol for isolating single cells from human pancreatic cancer tissues and analyzing major immune cell populations using flow cytometry. STAR Protoc. 4 (4), 102679(2023).
  23. Simoni, Y., Chng, M. H. Y., Li, S., Fehlings, M., Newell, E. W. Mass cytometry: A powerful tool for dissecting the immune landscape. Curr Opin Immunol. 51, 187-196 (2018).
  24. Comi, M., et al. Coexpression of cd163 and cd141 identifies human circulating il-10-producing dendritic cells (dc-10). Cell Mol Immunol. 17 (1), 95-107 (2020).
  25. Fan, L., et al. High-dimensional single-cell analysis delineates peripheral immune signature of coronary atherosclerosis in human blood. Theranostics. 12 (15), 6809-6825 (2022).
  26. Sheng, J., et al. Human endogenous retrovirus activation contributes to biliary atresia pathogenesis through re-education of resident macrophages. Biorxiv. , (2022).
  27. Terekhova, M., et al. Single-cell atlas of healthy human blood unveils age-related loss of nkg2c(+)gzmb(-)cd8(+) memory t cells and accumulation of type 2 memory t cells. Immunity. 56 (12), 2836-2854.e9 (2023).
  28. Sathaliyawala, T., et al. Distribution and compartmentalization of human circulating and tissue-resident memory t cell subsets. Immunity. 38 (1), 187-197 (2013).
  29. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology. 12 (3), 395(2023).
  30. Iyer, A., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Cytof for the masses. Front Immunol. 13, 815828(2022).
  31. Yuan, X., Wang, J., Huang, Y., Shangguan, D., Zhang, P. Single-cell profiling to explore immunological heterogeneity of tumor microenvironment in breast cancer. Front Immunol. 12, 643692(2021).
  32. Serban, G. M., Mănescu, I. B., Manu, D. R., Dobreanu, M. Optimization of a density gradient centrifugation protocol for isolation of peripheral blood mononuclear cells. Acta Marisiensis - Seria Medica. 64 (2), 83-90 (2018).
  33. Shcherbakova, A., et al. Factors affecting cell viability during the enzymatic dissociation of human endocrine tumor tissues. Biology (Basel). 13 (9), 665(2024).
  34. Devine, R. D., Alkhalaileh, H. S., Lyberger, J. M., Behbehani, G. K. Alternative methods of viability determination in single cell mass cytometry. Cytometry A. 99 (10), 1042-1053 (2021).
  35. Gonzalez, V. D., Huang, Y. W., Fantl, W. J. Mass cytometry for the characterization of individual cell types in ovarian solid tumors. Methods Mol Biol. 2424, 59-94 (2022).
  36. Zabransky, D. J., et al. Profiling of syngeneic mouse hcc tumor models as a framework to understand anti-pd-1 sensitive tumor microenvironments. Hepatology. 77 (5), 1566-1579 (2023).
  37. Levine, L. S., et al. Single-cell analysis by mass cytometry reveals metabolic states of early-activated cd8(+) t cells during the primary immune response. Immunity. 54 (4), 829-844.e5 (2021).
  38. Lv, B., et al. Immunotherapy: Reshape the tumor immune microenvironment. Front Immunol. 13, 844142(2022).
  39. Zhou, Z., et al. Deciphering the tumor immune microenvironment from a multidimensional omics perspective: Insight into next-generation car-t cell immunotherapy and beyond. Mol Cancer. 23 (1), 131(2024).
  40. Hsieh, W. C., et al. Spatial multi-omics analyses of the tumor immune microenvironment. J Biomed Sci. 29 (1), 96(2022).
  41. Wang, Z., et al. Gdf15 induces immunosuppression via cd48 on regulatory t cells in hepatocellular carcinoma. J Immunother Cancer. 9 (9), e002787(2021).
  42. Krams, S. M., Schaffert, S., Lau, A. H., Martinez, O. M. Applying mass cytometry to the analysis of lymphoid populations in transplantation. Am J Transplant. 17 (8), 1992-1999 (2017).

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