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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit une méthode d’analyse complète de cytométrie de masse (cytométrie par temps de vol [CyTOF]) pour évaluer les réponses immunitaires systémiques et locales dans le carcinome hépatocellulaire (CHC). L’approche vise à fournir des informations sur le paysage immunitaire du CHC, offrant une compréhension plus profonde du microenvironnement tumoral et des mécanismes immunitaires associés.

Résumé

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est l’une des formes les plus courantes et les plus mortelles de cancer du foie dans le monde. Malgré les progrès du traitement, le pronostic des patients atteints de CHC reste sombre en raison de l’interaction complexe des facteurs génétiques, environnementaux et immunologiques à l’origine de sa progression. La compréhension du paysage immunitaire du CHC est cruciale pour développer des thérapies efficaces, en particulier dans le domaine de l’immunothérapie, qui est très prometteuse pour l’amélioration des résultats pour les patients. Cette étude utilise la technologie de cytométrie de masse (cytométrie par temps de vol [CyTOF]) pour étudier les réponses immunitaires systémiques et locales chez les patients atteints de CHC. En analysant des échantillons de sang périphérique et de tumeurs, la recherche vise à identifier des populations uniques de cellules immunitaires et leurs états fonctionnels associés à la progression du CHC. Les résultats fournissent un aperçu complet du paysage immunitaire dans le CHC, mettant en évidence des biomarqueurs et des cibles thérapeutiques potentiels. Cette approche offre des informations précieuses sur les mécanismes immunitaires sous-jacents au CHC et ouvre la voie au développement d’immunothérapies plus efficaces pour cette tumeur maligne.

Introduction

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le cancer primitif du foie le plus fréquent et un problème de santé mondial important en raison de son incidence élevée et de ses taux de mortalité1. Selon l’Organisation mondiale de la santé, le CHC se classe au cinquième rang des cancers les plus fréquents et au deuxième rang des causes de décès liés au cancer dans le monde2. Elle est particulièrement répandue dans les régions où les taux d’infections chroniques aux hépatites B et C sont élevés, comme l’Asie de l’Est et l’Afrique subsaharienne3. Les principaux facteurs de risque sont l’hépatite virale, la cirrhose et le syndrome métabolique4. Le CHC nécessite un traitement à long terme, imposant des charges physiques et financières considérables, soulignant la nécessité d’une prévention efficace, d’une détection précoce et de stratégies de traitement innovantes5.

Le système immunitaire joue un rôle crucial dans le développement du CHC. Le foie est un organe immunologiquement actif avec une abondance de cellules immunitaires, y compris des macrophages résidents du foie, des cellules tueuses naturelles (NK) et des cellules T, qui sont essentielles à la surveillance et à l’élimination des cellules anormales6. Cependant, le CHC peut échapper à la surveillance immunitaire en exprimant des molécules immunosuppressives, en recrutant des cellules immunosuppressives et en modifiant le microenvironnement tumoral 7,8. Cet échappement immunitaire favorise non seulement la croissance tumorale et les métastases, mais affecte également la réponse à l’immunothérapie 9,10.

Les réponses immunitaires systémiques et locales dans le microenvironnement tumoral sont des facteurs clés influençant la progression du cancer et les résultats thérapeutiques. Les réponses immunitaires systémiques impliquent des cellules immunitaires circulantes qui peuvent reconnaître et attaquer les cellules tumorales distantes, telles que les cellules T périphériques, les cellules NK et les monocytes qui peuvent cibler les cellules tumorales dans tout le corps. Les réponses immunitaires locales se concentrent sur l’activité des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral, y compris les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL), les macrophages associés à la tumeur (TAMs) et les lymphocytes T régulateurs (Tregs). Alors que les TIL exercent souvent des effets cytotoxiques contre les cellules tumorales, les TAM et les Tregs contribuent généralement à un environnement immunosuppresseur qui favorise la croissance tumorale11,12. Les cellules tumorales et les cellules stromales peuvent remodeler le microenvironnement tumoral pour favoriser l’immunosuppression et échapper à la surveillance immunitaire. L’interaction entre les réponses immunitaires systémiques et locales détermine l’efficacité globale de l’immunité antitumorale11. Comprendre cette interaction peut aider à développer des stratégies d’immunothérapie plus efficaces.

La cytométrie en flux et l’immunohistochimie traditionnelles, bien que largement utilisées dans les études immunologiques, présentent des limites importantes lorsqu’il s’agit d’analyser des paysages immunitaires complexes en raison de leur incapacité à effectuer une analyse complète et de grande dimension. La cytométrie en flux est très efficace pour détecter les marqueurs de surface et fonctionnels au niveau de la cellule unique. Cependant, sa capacité d’analyse simultanée de plusieurs marqueurs est limitée, souvent limitée par le chevauchement spectral et les contraintes pratiques sur le nombre de balises fluorescentes pouvant être utilisées13,14. L’immunohistochimie, quant à elle, fournit des informations précieuses sur le contexte tissulaire de marqueurs spécifiques, mais elle est également entravée par le nombre limité de marqueurs analysables et les difficultés inhérentes à la réalisation d’évaluations robustes, quantitatives et de grande dimension15.

Pour caractériser efficacement des environnements immunitaires complexes, des techniques de haute dimension comme la cytométrie de masse (cytométrie par temps de vol [CyTOF]) sont essentielles. La cytométrie de masse est une technologie de pointe qui utilise la spectrométrie de masse pour analyser plusieurs marqueurs protéiques dans des cellules uniques. Il permet une analyse multiparamétrique de cellules individuelles sans les problèmes de chevauchement spectral observés dans la cytométrie en flux traditionnelle16. En utilisant des anticorps marqués au métal, il peut mesurer des dizaines de marqueurs simultanément, offrant une vue complète et impartiale des phénotypes et des fonctions cellulaires17. Par exemple, Gadalla et al. ont développé un panel CyTOF avec plus de 40 paramètres pour l’analyse des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et du tissu tumoral, démontrant ainsi son avantage dans l’immunophénotypage de haute dimension18. La cytométrie en flux traditionnelle, avec son nombre limité de paramètres détectables, n’a pas permis d’identifier ces populations cellulaires rares présentant des phénotypes uniques. En revanche, la cytométrie de masse a permis une évaluation complète des états fonctionnels de ces cellules, fournissant une caractérisation plus détaillée et plus robuste. Behbehani et al. ont utilisé la cytométrie de masse pour analyser des échantillons de moelle osseuse de patients atteints de syndromes myélodysplasiques (SMD), ce qui a permis d’identifier et de caractériser avec succès des cellules progénitrices hématopoïétiques aberrantes rares18. La capacité de la cytométrie de masse à détecter simultanément plus de 40 marqueurs de surface et intracellulaires a considérablement amélioré la détection de ces sous-ensembles de cellules à basse fréquence19. Ces capacités surmontent les limites traditionnelles et fournissent des informations plus approfondies sur les paysages immunitaires, ce qui favorise les progrès en immunologie et le développement thérapeutique. La capacité de profiler de manière exhaustive les phénotypes et les fonctions cellulaires au niveau de la cellule unique fait progresser considérablement la compréhension des processus immunologiques et contribue au développement de thérapies ciblées.

La cytométrie de masse fournit des informations complètes sur les populations de cellules immunitaires systémiques et locales dans le CHC en détectant simultanément plusieurs marqueurs protéiques. Cette technologie permet de distinguer différents types de lymphocytes T au sein du microenvironnement tumoral, tels que les lymphocytes T effecteurs, les lymphocytes T régulateurs (Tregs) et les lymphocytes T épuisés, élucidant ainsi leurs rôles spécifiques dans la progression tumorale. En utilisant la cytométrie de masse, les chercheurs peuvent identifier des marqueurs immunitaires associés au pronostic20 du CHC. Par exemple, les sous-ensembles de lymphocytes T avec une expression élevée de la protéine de mort cellulaire programmée 1 (-1) peuvent servir de prédicteurs de la réponse d’un patient aux inhibiteurs de point de contrôle immunitaire21. De plus, il facilite la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques en identifiant des molécules immunosuppressives spécifiques, fournissant ainsi une base pour des stratégies de traitement personnalisées. La capacité de la technologie à détecter plusieurs marqueurs et sa résolution unicellulaire la rendent particulièrement avantageuse pour découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques et concevoir des immunothérapies combinées. Cette approche avancée présente un potentiel important pour améliorer les résultats du traitement chez les patients atteints de CHC en offrant une compréhension détaillée du paysage immunitaire et en permettant le développement d’interventions thérapeutiques sur mesure.

Cette étude vise à utiliser la cytométrie de masse pour analyser les profils cellulaires immunitaires systémiques et locaux des patients atteints de CHC. Les objectifs sont de caractériser les populations de cellules immunitaires, de corréler ces caractéristiques avec les résultats cliniques et les réponses thérapeutiques, et d’identifier des marqueurs immunitaires spécifiques et des sous-ensembles cellulaires associés au pronostic du CHC. En élucidant les rôles de diverses cellules immunitaires dans les réponses au traitement, cette étude cherche à fournir une base pour des stratégies de traitement personnalisées. Les résultats devraient optimiser les immunothérapies existantes et offrir des informations précieuses pour le développement de nouveaux traitements, dans le but ultime d’améliorer la survie globale et la qualité de vie des patients atteints de CHC.

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Protocole

Les étapes de prélèvement d’échantillons de sang et de CHC, d’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), de dissociation des cellules uniques et de coloration sont décrites dans le plan suivant. Les réactifs et les matériaux expérimentaux sont tous répertoriés dans la table des matériaux. Toutes les expériences ont été réalisées avec l’approbation du comité d’éthique du premier hôpital affilié de la faculté de médecine de l’Université du Zhejiang, en veillant à ce que la collecte d’échantillons tumoraux n’interfère pas avec le diagnostic pathologique. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les sujets humains.

1. Isolement des PBMC

  1. Prélevez un échantillon de sang dans la veine des patients atteints de CHC et utilisez un tube rempli d’un anticoagulant pour empêcher le sang de coaguler. Des échantillons de sang ont été prélevés sur 4 patients (2 hommes et 2 femmes) âgés de 50 à 60 ans, avec un âge moyen de 55 ans. Pour chaque patient, prélever 10 à 20 ml de sang périphérique afin d’assurer un volume suffisant pour l’isolement ultérieur des PBMC tout en minimisant l’inconfort du patient.
  2. Prélevez un volume spécifique de sang (par exemple, 6 ml) et ajoutez un volume égal de liquide de séparation des lymphocytes du sang périphérique (Ficol-paque ou Lymphoprep) dans un tube à centrifuger de 15 ml.
    REMARQUE : Le volume total ne doit idéalement pas dépasser 12 mL afin de laisser de l’espace pour un bon mélange et d’éviter les débordements ; le volume maximal recommandé pour un tube à centrifuger de 15 mL est de 14 mL.
  3. Inclinez le tube de centrifugation à 45° et ajoutez lentement le sang le long de la paroi du tube, en déposant soigneusement le sang lentement sur le liquide de séparation des lymphocytes du sang périphérique pour éviter de mélanger les deux couches.
    REMARQUE : Une pipette peut être utilisée pour ajouter lentement du sang le long de la paroi du tube.
  4. Placez le tube de centrifugation dans la centrifugeuse et réglez l’accélération à 8 et la décélération à 3. Centrifugeuse à 450 x g, 4 °C, pendant 30 min. Après centrifugation, 4 couches se forment dans le tube à essai, de haut en bas : couche de plasma, couche PBMC (couche de membrane blanche), couche de Ficol-Pâque, couche de globules rouges et couche de granulocytes.
  5. À l’aide d’une pipette, prélevez soigneusement la couche de PBMC dans un nouveau tube à centrifuger stérile. Ajouter 3 fois le volume de PBS et centrifuger à 500 x g à 4°C pendant 5 min. Après centrifugation, une pastille se forme au fond du tube.
  6. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, ajouter 1 mL de solution saline tamponnée au sérum de veau et au phosphate de veau fœtal à 2 % (FBS-PBS) pour remettre les cellules en suspension, puis ajouter 3 mL de tampon de lyse des globules rouges (GR). Centrifugeuse à 500 x g à 4°C pendant 5 min.
  7. Assurez-vous qu’il n’y a pas de globules rouges au fond du tube, ce qui indique que les globules rouges ont été complètement lysés. Remettez les cellules en suspension dans 2 % de FBS-PBS et procédez directement aux expériences suivantes, ou ajoutez une solution de cryoconservation cellulaire et conservez-la à -80°C pendant 2-3 mois.
    REMARQUE : En règle générale, pour la remise en suspension, utilisez 0,5 mL de FBS-PBS à 2 % par 1 x 106 cellules. Le nombre de cellules est déterminé à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé après coloration au bleu de trypan pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Ce rapport permet d’assurer une récupération et une viabilité cellulaires optimales lors des procédures ultérieures.

2. Isolement des cellules du tissu tumoral

REMARQUE : La méthode d’isolement des cellules du tissu tumoral a été adaptée de Song et al.22.

  1. Après avoir réséqué le CHC, guidé par un pathologiste, utilisez un scalpel stérile pour exciser une partie du tissu tumoral. Le bloc de tissu doit mesurer environ 1 cm3 . Rincez toutes les taches de surface avec du PBS 1x pré-réfrigéré. Immergez le tissu dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant environ 5 ml de milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS. Placez le tube sur de la glace et transportez-le au laboratoire pour un traitement ultérieur.
  2. Rincez abondamment les taches de sang et retirez manuellement le tissu conjonctif adipeux à l’aide d’une pince pour assurer un nettoyage complet des tissus avec du FBS-PBS pré-refroidi à 2 %. Transférez le tissu dans une boîte traitée par culture tissulaire contenant une solution de digestion. Fixez le tissu tumoral avec une pince et coupez-le en morceaux inférieurs à 1mm3 avec un scalpel. Transférez la solution de digestion tissulaire dans un tube à centrifuger de 50 ml, en ajoutant plus de solution de digestion tissulaire jusqu’à ce que le volume total soit d’environ 15 ml.
  3. Placez le tube à centrifuger contenant le mélange de digestion tissulaire dans un agitateur. Inclinez-le ou aplatissez-le et fixez-le pour la digestion à 150 tr/min et 37 °C pendant 1 h. Filtrez la solution de digestion à travers un filtre de 70 μm.
    1. Au cours de cette procédure, utilisez un piston de seringue de 1 ml pour broyer les fragments de tissu. Rincez le filtre avec une solution FBS-1640 à 2 %. Prenez le filtrat et transférez-le dans un tube à centrifuger de 15 ml.
  4. Centrifuger le filtrat à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Après la centrifugation, jeter le surnageant. Remettre prudemment la pastille en suspension dans environ 10 ml de solution Percoll à 36 %. Ensuite, centrifugez-le à nouveau à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
  5. Aspirez doucement 1 mL de tampon de lyse des globules rouges à l’aide d’une pipette pour remettre la suspension cellulaire en suspension. Transférez la suspension dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL et ajoutez le tampon de lyse des globules rouges pour atteindre un volume total de 10 mL. Laissez reposer le mélange à température ambiante pendant 10 min.
    REMARQUE : Un nouveau tube de centrifugation est utilisé pour empêcher les impuretés sur la paroi du tube de pénétrer à nouveau dans la suspension cellulaire, réduisant ainsi le risque de diminution du rendement des cellules.
  6. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à 4 °C, puis remettre les cellules en suspension dans un volume approprié de 2 % de FBS-PBS. En règle générale, utiliser 0,5 mL de FBS-PBS à 2 % par 1 x 106 cellules pour la remise en suspension.
    REMARQUE : Le nombre de cellules est déterminé à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé après coloration au bleu de trypan pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Le volume de remise en suspension dépend de la quantité de cellules requise pour les expériences ultérieures. Ce rapport permet d’assurer une récupération et une viabilité cellulaires optimales lors des procédures ultérieures.

3. Coloration au cisplatine

  1. Prenez 3 x 10cellules 6 des PBMC obtenues à l’étape 1.7 et des cellules tumorales isolées à l’étape 2.6, respectivement. Après la récupération cellulaire, les remettre en suspension dans 1 mL de PBS sans Ca2+ et Mg2+. Ajouter le cisplatine à une concentration finale de 0,5 μM, bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 2 min.
    REMARQUE : La coloration au cisplatine est effectuée pour distinguer les cellules mortes des cellules vivantes en fonction de l’intégrité de la membrane. Les cellules mortes dont les membranes sont compromises absorbent le cisplatine et montrent un signal positif, tandis que les cellules vivantes restent non colorées23. Le nombre de cellules doit être d’au moins 1 x 106.
  2. Centrifuger les tubes à 500 x g pendant 5 min à température ambiante, jeter le surnageant, puis ajouter 1 mL de tampon de coloration cellulaire à chaque tube contenant les suspensions cellulaires préparées à l’étape 3.1 pour arrêter la réaction. Centrifugez à 500 x g pendant 5 min à température ambiante, jetez le surnageant et assurez-vous que la pastille de cellule n’est pas distribuée linéairement le long de la paroi du tube après la centrifugation.

4. Blocage du récepteur Fc

  1. Préparez à l’avance un mélange de blocs de 50 μL pour chaque échantillon : Combinez 48 μL de tampon de coloration cellulaire, puis ajoutez 2 μL de solution bloquante Fc (tampon de coloration cellulaire : solution bloquante Fc = 9:1).
  2. Suspendez les cellules de l’étape 3.2 dans le mélange ci-dessus et laissez-les reposer à température ambiante pendant 10 min.

5. Incubation d’anticorps protéiques membranaires

  1. Pour chaque échantillon de cellule obtenu à l’étape 4.2, préparer le mélange d’anticorps protéiques membranaires en ajoutant 1,1 μL de chaque anticorps. Ensuite, ajoutez un tampon de coloration cellulaire pour atteindre un volume final de 55 μL. À ce stade, le volume total est d’environ 100 μL.
    REMARQUE : Le mélange comprend des anticorps ciblant les principales protéines membranaires, telles que CD163, CCR3, CD141, CD117 et CD4524,25. Ces anticorps ont été sélectionnés pour leur spécificité dans l’identification des marqueurs de protéines membranaires et ont été obtenus à partir de sources disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux pour plus de détails, y compris les numéros de clones, les fabricants et les numéros de catalogue).
  2. Ajouter 50 μL de mélange d’anticorps préparé à chaque échantillon de tube, porter le volume total à 100 μL. Agiter doucement les échantillons et les incuber à température ambiante pendant 15 min.
  3. Ajouter 2 mL de tampon de coloration cellulaire à chaque échantillon, centrifuger à 500 x g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant. Répétez cette étape 2 fois.
  4. Jetez le surnageant et agitez brièvement le liquide restant avec la pastille cellulaire pour la remettre en suspension et disperser complètement la cellule.

6. Coloration des protéines du noyau

  1. Une fois que les cellules ont été complètement remises en suspension, ajoutez 500 μL de la solution mélangée (fixation : fixation/perméabilisation = 3:1) à chaque échantillon de l’étape 5.4. Mélangez délicatement les échantillons et incubez à température ambiante pendant 30 min.
  2. Diluer le tampon de perméabilisation (10x) avec de l’eau déminéralisée. Après l’incubation, centrifuger à 500 g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant. Ajoutez 1000 μL de 1x tampon de perméabilisation dans chaque tube pour laver les cellules. Centrifuger à température ambiante à 1 000 x g pendant 5 min, puis jeter le surnageant.
  3. Remettre les anticorps en suspension dans 1 tampon de perméabilisation. Jetez le surnageant et ajoutez 50 μL du mélange d’anticorps dans chaque tube de cellules. Pipetez doucement les cellules pour mélanger, puis incubez à température ambiante pendant 30-45 min.
  4. Ajouter 1000 μL de 1 tampon de perméabilisation dans chaque tube, centrifuger à température ambiante à 1 000 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
  5. Ajoutez 1000 μL de tampon de coloration cellulaire dans chaque tube pour remettre les cellules en suspension, centrifugez à température ambiante à 1 000 x g pendant 5 min et jetez le surnageant.

7. Fixation cellulaire

  1. Préparez une solution de formaldéhyde à 1,6 % dans du PBS, avec 1 mL nécessaire par échantillon.
  2. Ajouter 1 mL de solution de formaldéhyde à 1,6 % à chaque échantillon à partir de l’étape 6.5, agiter au tourbillon et incuber à température ambiante pendant 10 min.
    REMARQUE : Bien que le formaldéhyde soit couramment utilisé pour la fixation des cellules, des réactifs alternatifs tels que le paraformaldéhyde à 4 % (PFA) ou le méthanol peuvent également être utilisés. Le choix du fixateur doit être basé sur les exigences spécifiques de l’expérience et les caractéristiques cellulaires à observer.
  3. Centrifuger à température ambiante à 800 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.

8. Coloration par intercalation nucléaire

  1. Préparez une solution d’intercalation cellulaire : Diluez Cell-ID Intercalator-Iridium (Ir) avec Fix et un tampon de perméabilisation à une concentration finale de 125 nM. Préparez 1 mL de solution par échantillon.
  2. Ajouter 1 mL de la solution d’intercalation cellulaire préparée à chaque échantillon fixé de l’étape 7.3. Mélangez doucement et agitez immédiatement. Cela aide à minimiser la formation d’agrégats cellulaires.
  3. Incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4°C pendant la nuit. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant.

9. Préparation de la suspension cellulaire

  1. Ajouter 1000 μL de tampon de coloration cellulaire dans le tube à partir de l’étape 8.3 et centrifuger à 800 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant. Répétez cette étape 2 fois.
  2. Ajoutez 450 μL à 900 μL d’eau déminéralisée pour remettre les cellules en suspension. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé après la coloration au bleu de trypan. Après le comptage, procéder à la collecte et à l’analyse des données à l’aide de la cytométrie de masse.

10. Cytométrie de masse et analyse des données

  1. Acquérez des données de cytométrie de masse à l’aide d’un système CyTOF et enregistrez-les en tant que fichiers FCS (Flow Cytometry Standard). Assurez-vous que l’étalonnage de l’instrument et le contrôle de la qualité sont corrects pour réduire le bruit de fond et les effets de lot, conformément aux instructions du fabricant.
  2. Prétraitez le remplissage de cellules CD45+ dans le fichier FCS à l’aide du logiciel associé. Éliminez les débris en fonction de la taille de la cellule (diffusion vers l’avant, FSC) et de la granularité (diffusion latérale, SSC). Exclure les doublets par déclenchement séquentiel des tracés FSC-A/FSC-H ou SSC-A/SSC-H. Éliminez les cellules mortes à l’aide de la coloration de viabilité, comme l’exclusion du cisplatine. Gate la population CD45+ pour se concentrer sur les cellules immunitaires et exporter la population fermée pour une analyse plus approfondie.
  3. Transformez les données avec un cofacteur de 5 et identifiez les principaux clusters à l’aide d’un logiciel de clustering. Effectuez un clustering basé sur l’algorithme SPADE (Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events), qui regroupe les cellules ayant des profils d’expression de marqueurs similaires en clusters26. Utilisez l’incorporation hiérarchique stochastique de voisins voisins (HSNE) pour la réduction de la dimensionnalité et l’identification de clusters distincts26.
  4. Effectuez le reclustering des clusters majeurs à l’aide du package cytofkit dans le logiciel R pour le clustering non supervisé. Identifiez les sous-clusters avec PhenoGraph à l’aide des paramètres par défaut.
  5. Appliquez l’approximation et la projection uniformes de variété (UMAP) pour la réduction de la dimensionnalité. Effectuez une analyse statistique à l’aide du test de Wilcoxon, en considérant qu’une valeur P < 0,05 est statistiquement significative. Visualisez les résultats à l’aide de ggplot2.

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Résultats

Pour élucider les caractéristiques immunologiques associées au CHC, une analyse complète des populations de cellules immunitaires a été effectuée. Des échantillons appariés de PBMC et de tissu CHC ont été prélevés chez 4 patients atteints de CHC. Un profilage par cytométrie de masse a été effectué pour examiner les populations de cellules immunitaires au niveau protéomique unicellulaire, à l’aide de deux panels d’anticorps pour les ...

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Discussion

Cette étude s’appuie sur la technologie de la cytométrie de masse pour fournir une analyse approfondie des réponses immunitaires systémiques et locales dans le CHC. L’application de la cytométrie de masse dans ce contexte permet la détection simultanée de plusieurs marqueurs au niveau d’une seule cellule, offrant une caractérisation immunophénotypique détaillée qui est cruciale pour comprendre le paysage immunitaire complexe du CHC. La cytométrie de masse a révolutionn...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Programme national de recherche et de développement clés de Chine (subvention 2019YFA0803000 à J.S.), l’Excellent Youth Foundation of Zhejiang Scientific (subvention R22H1610037 à J.S.), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention 82173078 à J.S.), la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (subvention 2022C03037 à J.S.).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1×PBSHyCloneSH30256.01
10×PBSHyCloneSH30256.01
100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dishCorning430167
1000 mL pipette tipsRainin30389218
15 mL centrifuge tubeNEST601052
200 mL pipette tipsRainin30389241
40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainerFalcon352340
50 mL centrifuge tubeNEST602052
70 μm syringe fifilterSangon BiotechF613462-9001
Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)BioLegend357224
Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)BioLegend310724
Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)BioLegend353240
Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)BioLegend350202
Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)BioLegend347314
Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)BioLegend313201
Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) BD562721
Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) BD563026
Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)BioLegend306002
Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)BioLegend351337
Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)BioLegend301701
Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)BioLegend356535
Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)BioLegend325604
Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)BioLegend344102
Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)BioLegend376302
Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) BD561313
Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)BioLegend339902
Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)BioLegend333603
Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)BioLegend346002
Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)BioLegend302226
Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)BioLegend331501
Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)BioLegend302301
Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)BioLegend321151
Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)BioLegend311129
Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)BioLegend302624
Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) BD555916
Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)BioLegend375902
Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)BioLegend303232
Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)BioLegend369812
Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)BioLegend303402
Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) BD563094
Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) BD563716
Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)BioLegend304220
Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)BioLegend362510
Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)BioLegend399502
Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)BioLegend392917
Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)BioLegend333808
Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)BioLegend310902
Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)BioLegend395602
Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) BD557750
Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)BioLegend375402
Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)BioLegend374202
Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)BioLegend320101
Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)BioLegend311426
Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)BioLegend307650
Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)BioLegend348211
Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)BioLegend350501
Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)BD567783
Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)BioLegend329951
Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)BioLegend393602
Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) BD740415
Cell cryopreservation solutionThermo FisherA2644601
Cell-lD CisplatinStandard BioTools201064
Cell-lD Intercalator-lrStandard BioTools201192A
Collagenase, Type IVGibco17104019
Constant-temperature shakeFAITHFULFS-50B
CyTOF SystemFluidigm CorporationHelios
CytosploreCytosplore Consortium2.3.1
Dispase IIGibco17105041
DNase IMerckDN25
Eppendorf centrifugeEppendorf5702
EQ Four Element Calibration BeadsStandard BioTools201078
FBSGibco16000-044
Ficoll-paqueCytiva17-1440-02
FinnpipetteThermo Scientific4700870
Fixation bufferThermo ScientificFB001
FlowJoBD Life Sciences10.1
Formaldehyde solutionThermo Scientific28906
Granzyme B Antibody, anti-human/mouse (clone: QA16A02)BioLegend396413
Heparin TubesBD367874
Human BD Fc Block 2.5 mg/mLBD564220
MACS Tissue Storage SolutionMiltenyi130-100-008
Maxpar Fix and Perm BufferStandard BioTools201067
Maxpar metal-coniugated antibodiesStandard BioToolsVarious
Maxpar PBSStandard BioTools201058
Maxpar WaterStandard BioTools201069
Maxpare Cell Staining BufferStandard BioTools201068
Metal-conjugated Anti-Human α-SMA Antibody (clone: 1A4)Miltenyi Biotec130-098-145
PercollMerckP4937-500ML
Permeabilization bufferThermo Scientific00833356
RBC lysis bufferBD555899
Refrigerated centrifugeEppendorf5910ri
RPMI 1640 medium GE HealthCareSH30027.0
ScalpelAPPLYGENTB6298-1
Sterile Pasteur pipetteZDANZD-H03
Tissue digestion solutionYeasen Biotech41423ES30
Tuning SolutionStandard BioTools201072
Vortex MixerThermo Scientific88882012

Références

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