JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, hepatoselüler karsinomda (HCC) hem sistemik hem de lokal immün yanıtları değerlendirmek için kapsamlı bir kütle sitometrisi (uçuş süresine göre sitometri [CyTOF]) analiz yöntemini ana hatlarıyla belirtir. Yaklaşım, tümör mikro çevresi ve ilişkili bağışıklık mekanizmaları hakkında daha derin bir anlayış sunarak HCC'nin bağışıklık manzarası hakkında bilgi sağlamayı amaçlamaktadır.

Özet

Hepatosellüler karsinom (HCC), dünya çapında karaciğer kanserinin en yaygın ve en ölümcül formlarından biridir. Tedavideki ilerlemelere rağmen, HCC hastalarının prognozu, ilerlemesini yönlendiren genetik, çevresel ve immünolojik faktörlerin karmaşık etkileşimi nedeniyle zayıf kalmaktadır. HCC'nin bağışıklık ortamını anlamak, özellikle hasta sonuçlarını iyileştirmek için büyük vaatlerde bulunan immünoterapi alanında etkili tedaviler geliştirmek için çok önemlidir. Bu çalışma, HCC'li hastalarda hem sistemik hem de lokal immün yanıtları araştırmak için kütle sitometrisi (uçuş süresine göre sitometri [CyTOF]) teknolojisini kullanmaktadır. Araştırma, periferik kan ve tümör örneklerini analiz ederek, benzersiz bağışıklık hücresi popülasyonlarını ve bunların HCC ilerlemesi ile ilişkili fonksiyonel durumlarını tanımlamayı amaçlamaktadır. Bulgular, potansiyel biyobelirteçleri ve terapötik hedefleri vurgulayarak HCC'deki bağışıklık ortamına kapsamlı bir genel bakış sağlar. Bu yaklaşım, HCC'nin altında yatan bağışıklık mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sunar ve bu malignite için daha etkili immünoterapilerin geliştirilmesinin yolunu açar.

Giriş

Hepatosellüler karsinom (HCC) en sık görülen primer karaciğer kanseridir ve yüksek insidansı ve mortalite oranları nedeniyle önemli bir küresel sağlık sorunudur1. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, HCC dünya çapında en sık görülen beşinci kanser ve kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedeni olarak yer almaktadır2. Özellikle Doğu Asya ve Sahra altı Afrika gibi kronik hepatit B ve C enfeksiyonu oranlarının yüksek olduğu bölgelerde yaygındır3. Majör risk faktörleri arasında viral hepatit, siroz ve metabolik sendrombulunur 4. HCC, uzun süreli tedavi gerektirir, önemli fiziksel ve mali yükler getirir ve etkili önleme, erken teşhis ve yenilikçi tedavi stratejilerine duyulan ihtiyacın altını çizer5.

Bağışıklık sistemi, HCC'nin gelişiminde çok önemli bir rol oynar. Karaciğer, anormal hücrelerin izlenmesi ve ortadan kaldırılması için gerekli olan karaciğerde yerleşik makrofajlar, doğal öldürücü (NK) hücreler ve T hücreleri dahil olmak üzere bol miktarda bağışıklık hücresine sahip immünolojik olarak aktif bir organdır6. Bununla birlikte, HCC, immünosüpresif molekülleri eksprese ederek, immünosüpresif hücreleri işe alarak ve tümör mikroçevresini değiştirerek immün sürveyanstan kaçınabilir 7,8. Bu immün kaçış sadece tümör büyümesini ve metastazı teşvik etmekle kalmaz, aynı zamanda immünoterapiye yanıtı da etkiler 9,10.

Tümör mikroçevresindeki sistemik ve lokal immün yanıtlar, kanserin ilerlemesini ve terapötik sonuçları etkileyen anahtar faktörlerdir. Sistemik bağışıklık tepkileri, periferik T hücreleri, NK hücreleri ve vücuttaki tümör hücrelerini hedef alabilen monositler gibi uzak tümör hücrelerini tanıyabilen ve bunlara saldırabilen dolaşımdaki bağışıklık hücrelerini içerir. Lokal immün yanıtlar, tümör infiltre eden lenfositler (TIL'ler), tümörle ilişkili makrofajlar (TAM'lar) ve düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) dahil olmak üzere tümör mikroçevresi içindeki immün hücre aktivitesine odaklanır. TIL'ler sıklıkla tümör hücrelerine karşı sitotoksik etkiler gösterirken, TAM'ler ve Treg'ler tipik olarak tümör büyümesini destekleyen immünosupresif bir ortama katkıda bulunur11,12. Tümör hücreleri ve stromal hücreler, immünosupresyona teşvik etmek ve immün sürveyansın kaçışını önlemek için tümör mikroçevresini yeniden şekillendirebilir. Sistemik ve lokal immün yanıtlar arasındaki etkileşim, anti-tümör bağışıklığının genel etkinliğini belirler11. Bu etkileşimi anlamak, daha etkili immünoterapi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

Geleneksel akış sitometrisi ve immünohistokimya, immünolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmakla birlikte, kapsamlı, yüksek boyutlu analiz yapamamaları nedeniyle karmaşık bağışıklık manzaralarının analizi söz konusu olduğunda önemli sınırlamalar sergilemektedir. Akış sitometrisi, tek hücre düzeyinde yüzey ve fonksiyonel belirteçleri tespit etmek için oldukça etkilidir; Bununla birlikte, eşzamanlı çok işaretli analiz kapasitesi sınırlıdır, genellikle spektral örtüşme ve kullanılabilecek floresan etiketlerin sayısı üzerindeki pratik kısıtlamalarla sınırlıdır13,14. Öte yandan immünohistokimya, belirli belirteçlerin doku bağlamına ilişkin değerli bilgiler sağlar, ancak benzer şekilde, sınırlı sayıda analiz edilebilir belirteç ve sağlam, nicel, yüksek boyutlu değerlendirmeler elde etmenin doğasında var olan zorluklar tarafından engellenir15.

Karmaşık bağışıklık ortamlarını etkili bir şekilde karakterize etmek için, kütle sitometrisi (uçuş süresine göre sitometri [CyTOF]) gibi yüksek boyutlu teknikler gereklidir. Kütle sitometrisi, tek hücrelerde birden fazla protein markörünü analiz etmek için kütle spektrometresi kullanan ileri bir teknolojidir. Geleneksel akış sitometrisinde16 görülen spektral örtüşme sorunları olmadan tek tek hücrelerin multiparametrik analizini sağlar. Metal etiketli antikorları kullanarak, düzinelerce belirteci aynı anda ölçebilir ve hücresel fenotiplerin ve işlevlerin kapsamlı ve tarafsız bir görünümünü sunar17. Örneğin, Gadalla ve ark. periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) ve tümör dokusunun analizi için 40'tan fazla parametreye sahip bir CyTOF paneli geliştirdi ve yüksek boyutlu immünofenotip18'deki avantajını gösterdi. Sınırlı sayıda saptanabilir parametresi olan geleneksel akış sitometrisi, benzersiz fenotipler sergileyen bu nadir hücre popülasyonlarını tanımlayamadı. Buna karşılık, kütle sitometrisi, bu hücrelerin fonksiyonel durumlarının kapsamlı bir değerlendirmesini mümkün kılarak daha ayrıntılı ve sağlam bir karakterizasyon sağladı. Behbehani ve ark. miyelodisplastik sendromlu (MDS) hastalardan alınan kemik iliği örneklerini analiz etmek için kitle sitometrisini kullandı ve nadir görülen anormal hematopoietik progenitör hücreleri başarılı bir şekilde tanımladı ve karakterize etti18. Kütle sitometrisinin 40'tan fazla yüzey ve hücre içi belirteci aynı anda tespit etme yeteneği, bu düşük frekanslı hücre alt kümelerinin tespitini önemli ölçüde artırdı19. Bu yetenekler, geleneksel sınırlamaların üstesinden gelir ve bağışıklık manzaraları hakkında daha derin bilgiler sağlayarak immünoloji ve terapötik geliştirmede ilerlemeyi sağlar. Hücresel fenotipleri ve fonksiyonları tek hücre düzeyinde kapsamlı bir şekilde profilleme yeteneği, immünolojik süreçlerin anlaşılmasını büyük ölçüde ilerletir ve hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olur.

Kütle sitometrisi, aynı anda birden fazla protein markörünü tespit ederek HCC'deki sistemik ve lokal immün hücre popülasyonları hakkında kapsamlı bilgiler sağlar. Bu teknoloji, efektör T hücreleri, düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) ve tükenmiş T hücreleri gibi tümör mikroçevresi içindeki çeşitli T hücresi türleri arasında ayrım yapabilir ve tümör ilerlemesindeki spesifik rollerini açıklayabilir. Araştırmacılar, kütle sitometrisini kullanarak HCC prognozu20 ile ilişkili bağışıklık belirteçlerini belirleyebilirler. Örneğin, yüksek Programlanmış Hücre Ölümü Proteini 1 (PD-1) ekspresyonuna sahip T hücresi alt kümeleri, bir hastanın bağışıklık kontrol noktası inhibitörlerine21 verdiği yanıtın belirleyicileri olarak hizmet edebilir. Ek olarak, spesifik immünosupresif molekülleri tanımlayarak yeni terapötik hedeflerin keşfedilmesini kolaylaştırır, böylece kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri için bir temel sağlar. Teknolojinin birden fazla belirteci tespit etme yeteneği ve tek hücreli çözünürlüğü, onu yeni terapötik hedeflerin ortaya çıkarılması ve kombinasyon immünoterapilerinin tasarlanması için özellikle avantajlı kılmaktadır. Bu gelişmiş yaklaşım, bağışıklık ortamının ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlayarak ve özel terapötik müdahalelerin geliştirilmesini sağlayarak HCC hastalarında tedavi sonuçlarını iyileştirmek için önemli bir potansiyele sahiptir.

Bu çalışmada HCC'li hastaların sistemik ve lokal immün hücre profillerini analiz etmek için kütle sitometrisinden yararlanılmalıdır. Amaç, immün hücre popülasyonlarını karakterize etmek, bu özellikleri klinik sonuçlar ve terapötik yanıtlarla ilişkilendirmek ve HCC prognozu ile ilişkili spesifik immün belirteçleri ve hücre alt kümelerini tanımlamaktır. Bu çalışma, çeşitli bağışıklık hücrelerinin tedavi yanıtlarındaki rollerini açıklayarak, kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri için bir temel sağlamayı amaçlamaktadır. Bulguların mevcut immünoterapileri optimize etmesi ve yeni tedaviler geliştirmek için değerli bilgiler sunması ve sonuçta HCC hastaları için genel sağkalımı ve yaşam kalitesini iyileştirmeyi hedeflemesi bekleniyor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Kan ve HCC örneği toplama, periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) izolasyonu, tek hücre ayrışması ve boyama adımları aşağıdaki planda özetlenmiştir. Deneysel reaktifler ve malzemelerin tümü Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Tüm deneyler, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi Birinci Bağlı Hastane Etik Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirildi ve tümör örneklerinin toplanmasının patolojik tanıya müdahale etmediğinden emin olundu. Tüm insan deneklerden yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.

1. PBMC'lerin İzolasyonu

  1. HCC hastalarının damarından bir kan örneği alın ve kanın pıhtılaşmasını önlemek için antikoagülan ile doldurulmuş bir tüp kullanın. Yaşları 50-60 arasında değişen, yaş ortalaması 55 olan 4 hastadan (2 erkek ve 2 kadın) kan örneği alındı. Her hasta için, hasta rahatsızlığını en aza indirirken sonraki PBMC izolasyonu için yeterli hacmi sağlamak için 10-20 mL periferik kan toplayın.
  2. Belirli bir hacimde kan çekin (ör., 6 mL) ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne eşit hacimde periferik kan lenfosit ayırma sıvısı (Ficol-paque veya Lymphoprep) ekleyin.
    NOT: Uygun karıştırma için alan sağlamak ve taşmayı önlemek için toplam hacim ideal olarak 12 mL'yi geçmemelidir; 15 mL'lik bir santrifüj tüpü için önerilen maksimum hacim 14 mL'dir.
  3. Santrifüj tüpünü 45 ° 'ye eğin ve kanı tüpün duvarı boyunca yavaşça ekleyin, iki katmanın karışmasını önlemek için kanı yavaşça periferik kan lenfosit ayırma sıvısının üzerine dikkatlice yerleştirin.
    NOT: Tüpün duvarı boyunca yavaşça kan eklemek için bir pipet kullanılabilir.
  4. Santrifüj tüpünü santrifüje yerleştirin ve ivmeyi 8'e ve yavaşlamayı 3'e ayarlayın. 450 x g, 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, test tüpünde yukarıdan aşağıya doğru 4 katman oluşturulur: plazma katmanı, PBMC katmanı (beyaz zar katmanı), Ficol-Paque katmanı ve kırmızı kan hücresi ve granülosit katmanı.
  5. Bir pipet kullanarak, PBMC katmanını dikkatlice yeni bir steril santrifüj tüpüne toplayın. PBS hacminin 3 katını ekleyin ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de 500 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, tüpün dibinde bir pelet oluşur.
  6. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın, hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL %2 Fetal Sığır Serum-Fosfat Tamponlu Salin (FBS-PBS) ekleyin ve ardından 3 mL Kırmızı Kan Hücresi (RBC) lizis tamponu ekleyin. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 500 x g'da santrifüjleyin.
  7. Tüpün dibinde kırmızı kan hücrelerinin tamamen parçalandığını gösteren kırmızı kan hücresi olmadığından emin olun. Hücreleri %2 FBS-PBS'de yeniden süspanse edin ve doğrudan sonraki deneylere devam edin veya hücre kriyoprezervasyon solüsyonu ekleyin ve 2-3 ay boyunca -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Genel bir kural olarak, yeniden süspansiyon için 1 x 106 hücre başına 0,5 mL %2 FBS-PBS kullanın. Hücre sayısı, canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt etmek için tripan mavisi boyamadan sonra bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanılarak belirlenir. Bu oran, sonraki prosedürler sırasında optimum hücre geri kazanımını ve canlılığını sağlamaya yardımcı olur.

2. Tümör dokusu hücrelerinin izolasyonu

NOT: Tümör doku hücrelerinin izolasyonu için yöntem Song ve ark.22'den uyarlanmıştır.

  1. Bir patolog tarafından yönlendirilen HCC'yi rezeke ettikten sonra, tümör dokusunun bir kısmını çıkarmak için steril bir neşter kullanın. Doku bloğu yaklaşık 1cm3 boyutunda olmalıdır. Önceden soğutulmuş 1x PBS ile yüzey lekelerini durulayın. Dokuyu %10 FBS içeren yaklaşık 5 mL RPMI 1640 ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne daldırın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve daha sonraki işlemler için laboratuvara geri taşıyın.
  2. Kan lekelerini iyice durulayın ve önceden soğutulmuş %2 FBS-PBS ile tam doku temizliğini sağlamak için forseps kullanarak yağlı bağ dokusunu manuel olarak çıkarın. Dokuyu, bir sindirim çözeltisi içeren doku kültürü ile muamele edilmiş bir tabağa aktarın. Tümör dokusunu forseps ile sabitleyin ve bir neşter ile 1 mm'den3 daha küçük parçalar halinde kesin. Doku sindirim solüsyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve toplam hacim yaklaşık 15 mL olana kadar daha fazla doku sindirim solüsyonu ekleyin.
  3. Doku sindirim karışımını içeren santrifüj tüpünü bir çalkalayıcıya yerleştirin. Eğin veya düzleştirin ve 150 rpm'de ve 37 °C'de 1 saat boyunca sindirim için sabitleyin. Sindirim solüsyonunu 70 μm'lik bir filtreden süzün.
    1. Bu prosedür sırasında, doku parçalarını öğütmek için 1 mL'lik bir şırınga pistonu kullanın. Filtreyi% 2 FBS-1640 çözeltisi ile durulayın. Süzüntüyü alın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  4. Süzüntüyü 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın. Peletleri yaklaşık 10 mL% 36 Percoll çözeltisinde dikkatli bir şekilde yeniden süspanse edin. Ardından, 500 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da tekrar santrifüjleyin.
  5. Hücre süspansiyonunu yeniden süspanse etmek için 1 mL RBC lizis tamponunu bir pipetle nazikçe aspire edin. Süspansiyonu yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve toplam 10 mL'lik bir hacme ulaşmak için RBC lizis tamponunu ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
    NOT: Tüp duvarındaki herhangi bir yabancı maddenin hücre süspansiyonuna yeniden girmesini önlemek için yeni bir santrifüj tüpü kullanılır, böylece hücre veriminin düşme riskini azaltır.
  6. Hücre süspansiyonunu 500 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin, ardından hücreleri uygun bir %2 FBS-PBS hacminde yeniden süspanse edin. Genel bir kural olarak, yeniden süspansiyon için 1 x 106 hücre başına 0,5 mL% 2 FBS-PBS kullanın.
    NOT: Hücre sayısı, canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt etmek için tripan mavisi boyamadan sonra bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanılarak belirlenir. Yeniden süspansiyon hacmi, sonraki deneyler için gerekli hücre miktarına bağlıdır. Bu oran, sonraki prosedürler sırasında optimum hücre geri kazanımını ve canlılığını sağlamaya yardımcı olur.

3. Sisplatin boyama

  1. Adım 1.7'de elde edilen PBMC'lerden ve adım 2.6'da izole edilen tümör hücrelerinden sırasıyla 3 x 106 hücre alın. Hücre geri kazanımından sonra, bunları Ca2 + ve Mg2 + olmadan 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin. 0.5 μM'lik bir son konsantrasyona sisplatin ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
    NOT: Sisplatin boyama, zar bütünlüğüne dayalı olarak ölü hücreleri canlı hücrelerden ayırt etmek için yapılır. Zarları bozulmuş ölü hücreler sisplatin alır ve pozitif bir sinyal gösterirken, canlı hücreler lekesiz kalır23. Hücre sayısı en az 1 x 106 olmalıdır.
  2. Tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın, ardından reaksiyonu durdurmak için adım 3.1'de hazırlanan hücre süspansiyonlarını içeren her tüpe 1 mL hücre boyama tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve santrifüjlemeden sonra hücre peletinin tüpün duvarı boyunca doğrusal olarak dağılmadığından emin olun.

4. Fc reseptörü blokajı

  1. Her numune için önceden 50 μL'lik bir blok karışımı hazırlayın: 48 μL hücre boyama tamponunu birleştirin, ardından 2 μL Fc bloke etme solüsyonu ekleyin (hücre boyama tamponu: Fc bloke etme solüsyonu = 9: 1).
  2. Yukarıdaki karışımda adım 3.2'den hücreleri askıya alın ve 10 dakika oda sıcaklığında bekletin.

5. Membran protein antikorlarının inkübasyonu

  1. Adım 4.2'den elde edilen her hücre örneği için, her bir antikorun 1.1 μL birimi ekleyerek membran protein antikor karışımını hazırlayın. Ardından, 55 μL'lik bir nihai hacme ulaşmak için hücre boyama tamponu ekleyin. Bu noktada, toplam hacim yaklaşık 100 μL'dir.
    NOT: Karışım, CD163, CCR3, CD141, CD117 ve CD4524,25 gibi anahtar zar proteinlerini hedefleyen antikorları içerir. Bu antikorlar, membran protein belirteçlerini tanımlamadaki özgüllükleri için seçildi ve ticari olarak mevcut kaynaklardan elde edildi (klon numaraları, üreticiler ve katalog numaraları dahil olmak üzere ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. Her tüp örneğine 50 μL hazırlanmış antikor karışımı ekleyin, toplam hacmi 100 μL'ye getirin. Örnekleri yavaşça döndürün ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  3. Her numuneye 2 mL hücre boyama tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
  4. Süpernatanı atın ve hücreyi yeniden askıya almak ve iyice dağıtmak için kalan sıvıyı hücre peleti ile kısaca girdaplayın.

6. Çekirdek protein boyama

  1. Hücreler tamamen yeniden süspanse edildikten sonra, adım 5.4'teki her numuneye 500 μL karışık çözelti (fiksasyon: fiksasyon/geçirgenleştirme = 3: 1) ekleyin. Numuneleri nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  2. Geçirgenleştirme tamponunu (10x) deiyonize su ile seyreltin. İnkübasyondan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri yıkamak için her tüpe 1000 μL 1x geçirgenlik tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 1.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın.
  3. Antikorları 1x geçirgenlik tamponunda yeniden süspanse edin. Süpernatanı atın ve her bir hücre tüpüne 50 μL antikor karışımı ekleyin. Hücreleri karıştırmak için nazikçe pipetleyin, ardından oda sıcaklığında 30-45 dakika inkübe edin.
  4. Her tüpe 1000 μL 1x geçirgenlik tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 1.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  5. Hücreleri tekrar askıya almak için her tüpe 1000 μL hücre boyama tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 1.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

7. Hücre fiksasyonu

  1. PBS'de %1.6'lık bir formaldehit çözeltisi hazırlayın ve numune başına 1 mL gereklidir.
  2. Adım 6.5'teki her numuneye 1 mL %1.6 formaldehit çözeltisi ekleyin, iyice karıştırmak için girdap yapın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    NOT: Formaldehit, hücre fiksasyonu için yaygın olarak kullanılırken, %4 paraformaldehit (PFA) veya metanol gibi alternatif reaktifler de kullanılabilir. Fiksatif seçimi, deneyin özel gereksinimlerine ve gözlemlenecek hücresel özelliklere dayanmalıdır.
  3. Oda sıcaklığında 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

8. Nükleer İnterkalasyon Boyama

  1. Hücre interkalasyon çözeltisini hazırlayın: Hücre Kimliği İnterkalatörü-İridyumu (Ir) Fix ve geçirgenlik tamponu ile 125 nM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Numune başına 1 mL çözelti hazırlayın.
  2. Adım 7.3'ten itibaren her bir sabit örneğe hazırlanan hücre interkalasyon çözeltisinden 1 mL ekleyin. Yavaşça karıştırın ve hemen girdaplayın. Bu, hücre agregatlarının oluşumunu en aza indirmeye yardımcı olur.
  3. Oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4°C'de inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

9. Hücre süspansiyonunun hazırlanması

  1. Adım 8.3'ten tüpe 1000 μL hücre boyama tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
  2. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 450 μL ila 900 μL deiyonize su ekleyin. Tripan mavisi boyamadan sonra bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Saydıktan sonra, kütle sitometrisi kullanarak veri toplama ve analizine devam edin.

10. Kütle sitometrisi ve veri analizi

  1. Bir CyTOF sistemi kullanarak kütle sitometrisi verilerini alın ve Akış Sitometrisi Standardı (FCS) dosyaları olarak kaydedin. Üreticinin talimatlarına göre arka plan gürültüsünü ve toplu iş etkilerini azaltmak için uygun cihaz kalibrasyonunu ve kalite kontrolünü sağlayın.
  2. İlgili yazılımı kullanarak FCS dosyasındaki CD45+ hücre popülasyonunu önceden işleyin. Hücre boyutuna (ileri saçılma, FSC) ve ayrıntı düzeyine (yan saçılma, SSC) göre kalıntıları temizleyin. FSC-A/FSC-H veya SSC-A/SSC-H grafiklerinin sıralı geçitiyle çiftleri hariç tutun. Sisplatin dışlaması gibi canlılık boyamasını kullanarak ölü hücreleri ortadan kaldırın. Bağışıklık hücrelerine odaklanmak için CD45+ popülasyonunu kapatın ve daha fazla analiz için kapılı popülasyonu dışa aktarın.
  3. Verileri 5 kofaktörü ile dönüştürün ve kümeleme yazılımını kullanarak ana kümeleri tanımlayın. Benzer işaretleyici ifade profillerine sahip hücreleri kümeler halinde gruplandıran Yoğunluk Normalleştirilmiş Olayların Yayılma Ağacı İlerleme Analizi (SPADE) algoritmasına dayalı kümeleme gerçekleştirin26. Boyutsallığın azaltılması ve farklı kümelerin tanımlanması için Hiyerarşik Stokastik Komşu Gömme (HSNE) kullanın26.
  4. Denetimsiz kümeleme için R yazılımındaki cytofkit paketini kullanarak ana kümelerin yeniden kümelenmesini gerçekleştirin. Varsayılan parametreleri kullanarak PhenoGraph ile alt kümeleri tanımlayın.
  5. Boyutsallığın azaltılması için Tekdüzen Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyonu (UMAP) uygulayın. 0.05'< bir P değerini istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul ederek Wilcoxon testini kullanarak istatistiksel analiz yapın. ggplot2 kullanarak sonuçları görselleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

HCC ile ilişkili immünolojik özellikleri aydınlatmak için, immün hücre popülasyonlarının kapsamlı bir analizi yapılmıştır. HCC'li 4 hastadan eşleştirilmiş PBMC'ler ve HCC doku örnekleri toplandı. Hem PBMC'ler hem de HCC doku örnekleri için iki antikor paneli kullanılarak, tek hücreli proteomik düzeyde bağışıklık hücresi popülasyonlarını incelemek için kütle sitometrisi profillemesi yapıldı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışma, HCC'de hem sistemik hem de lokal immün yanıtların derinlemesine bir analizini sağlamak için kütle sitometrisi teknolojisinden yararlanmaktadır. Bu bağlamda kütle sitometrisinin uygulanması, tek hücre düzeyinde birden fazla markörün aynı anda saptanmasını sağlayarak, HCC'nin karmaşık bağışıklık manzarasını anlamak için çok önemli olan ayrıntılı bir immünofenotipik karakterizasyon sunar. Kitle sitometrisi, yüksek boyutlu tek hücreli analiz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (JS'ye 2019YFA0803000 hibe), Zhejiang Scientific Mükemmel Gençlik Vakfı (JS'ye R22H1610037 hibe), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (JS'ye hibe 82173078), Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (JS'ye 2022C03037 hibe).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1×PBSHyCloneSH30256.01
10×PBSHyCloneSH30256.01
100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dishCorning430167
1000 mL pipette tipsRainin30389218
15 mL centrifuge tubeNEST601052
200 mL pipette tipsRainin30389241
40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainerFalcon352340
50 mL centrifuge tubeNEST602052
70 μm syringe fifilterSangon BiotechF613462-9001
Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)BioLegend357224
Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)BioLegend310724
Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)BioLegend353240
Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)BioLegend350202
Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)BioLegend347314
Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)BioLegend313201
Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) BD562721
Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) BD563026
Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)BioLegend306002
Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)BioLegend351337
Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)BioLegend301701
Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)BioLegend356535
Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)BioLegend325604
Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)BioLegend344102
Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)BioLegend376302
Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) BD561313
Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)BioLegend339902
Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)BioLegend333603
Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)BioLegend346002
Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)BioLegend302226
Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)BioLegend331501
Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)BioLegend302301
Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)BioLegend321151
Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)BioLegend311129
Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)BioLegend302624
Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) BD555916
Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)BioLegend375902
Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)BioLegend303232
Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)BioLegend369812
Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)BioLegend303402
Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) BD563094
Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) BD563716
Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)BioLegend304220
Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)BioLegend362510
Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)BioLegend399502
Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)BioLegend392917
Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)BioLegend333808
Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)BioLegend310902
Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)BioLegend395602
Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) BD557750
Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)BioLegend375402
Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)BioLegend374202
Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)BioLegend320101
Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)BioLegend311426
Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)BioLegend307650
Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)BioLegend348211
Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)BioLegend350501
Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)BD567783
Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)BioLegend329951
Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)BioLegend393602
Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) BD740415
Cell cryopreservation solutionThermo FisherA2644601
Cell-lD CisplatinStandard BioTools201064
Cell-lD Intercalator-lrStandard BioTools201192A
Collagenase, Type IVGibco17104019
Constant-temperature shakeFAITHFULFS-50B
CyTOF SystemFluidigm CorporationHelios
CytosploreCytosplore Consortium2.3.1
Dispase IIGibco17105041
DNase IMerckDN25
Eppendorf centrifugeEppendorf5702
EQ Four Element Calibration BeadsStandard BioTools201078
FBSGibco16000-044
Ficoll-paqueCytiva17-1440-02
FinnpipetteThermo Scientific4700870
Fixation bufferThermo ScientificFB001
FlowJoBD Life Sciences10.1
Formaldehyde solutionThermo Scientific28906
Granzyme B Antibody, anti-human/mouse (clone: QA16A02)BioLegend396413
Heparin TubesBD367874
Human BD Fc Block 2.5 mg/mLBD564220
MACS Tissue Storage SolutionMiltenyi130-100-008
Maxpar Fix and Perm BufferStandard BioTools201067
Maxpar metal-coniugated antibodiesStandard BioToolsVarious
Maxpar PBSStandard BioTools201058
Maxpar WaterStandard BioTools201069
Maxpare Cell Staining BufferStandard BioTools201068
Metal-conjugated Anti-Human α-SMA Antibody (clone: 1A4)Miltenyi Biotec130-098-145
PercollMerckP4937-500ML
Permeabilization bufferThermo Scientific00833356
RBC lysis bufferBD555899
Refrigerated centrifugeEppendorf5910ri
RPMI 1640 medium GE HealthCareSH30027.0
ScalpelAPPLYGENTB6298-1
Sterile Pasteur pipetteZDANZD-H03
Tissue digestion solutionYeasen Biotech41423ES30
Tuning SolutionStandard BioTools201072
Vortex MixerThermo Scientific88882012

Referanslar

  1. Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia. Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).
  2. Renne, S. L., et al. Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview. Pathologica. 113 (3), 203-217 (2021).
  3. Sayiner, M., Golabi, P., Younossi, Z. M. Disease burden of hepatocellular carcinoma: A global perspective. Dig Dis Sci. 64 (4), 910-917 (2019).
  4. Zhang, X., et al. Risk factors and prevention of viral hepatitis-related hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 11, 686962(2021).
  5. Zou, H., et al. Economic burden and quality of life of hepatocellular carcinoma in greater China: A systematic review. Front Public Health. 10, 801981(2022).
  6. Li, Y., You, Z., Tang, R., Ma, X. Tissue-resident memory t cells in chronic liver diseases: Phenotype, development and function. Front Immunol. 13, 967055(2022).
  7. Shen, K. Y., Zhu, Y., Xie, S. Z., Qin, L. X. Immunosuppressive tumor microenvironment and immunotherapy of hepatocellular carcinoma: Current status and prospectives. J Hematol Oncol. 17 (1), 25(2024).
  8. Oura, K., Morishita, A., Tani, J., Masaki, T. Tumor immune microenvironment and immunosuppressive therapy in hepatocellular carcinoma: A review. Int J Mol Sci. 22 (11), 5801(2021).
  9. Chen, Y., et al. Effect of infiltrating immune cells in tumor microenvironment on metastasis of hepatocellular carcinoma. Cell Oncol. 46 (6), 1595-1604 (2023).
  10. Du, Q., An, Q., Zhang, J., Liu, C., Hu, Q. Unravelling immune microenvironment features underlying tumor progression in the single-cell era. Cancer Cell Int. 24 (1), 143(2024).
  11. Xu, L., et al. Reshaping the systemic tumor immune environment (stie) and tumor immune microenvironment (time) to enhance immunotherapy efficacy in solid tumors. J Hematol Oncol. 15 (1), 87(2022).
  12. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 131(2021).
  13. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: Visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  14. Sahaf, B., Rahman, A., Maecker, H. T., Bendall, S. C. Biomarkers for immunotherapy of cancer: Methods and protocols. , Springer. New York, New York, NY. (2020).
  15. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8 (6), e68519(2013).
  16. Wu, K., et al. Redefining tumor-associated macrophage subpopulations and functions in the tumor microenvironment. Front Immunol. 11, 1731(2020).
  17. Elaldi, R., et al. High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture. Front Immunol. 12, 666233(2021).
  18. Gadalla, R., et al. Validation of cytof against flow cytometry for immunological studies and monitoring of human cancer clinical trials. Front Oncol. 9, 415(2019).
  19. Ijsselsteijn, M. E., Van Der Breggen, R., Farina Sarasqueta, A., Koning, F., De Miranda, N. A 40-marker panel for high dimensional characterization of cancer immune microenvironments by imaging mass cytometry. Front Immunol. 10, 2534(2019).
  20. Zhang, Q., et al. Mass cytometry-based peripheral blood analysis as a novel tool for early detection of solid tumours: A multicentre study. Gut. 72 (5), 996-1006 (2023).
  21. Zheng, B., et al. Trajectory and functional analysis of pd-1(high) cd4(+)cd8(+) t cells in hepatocellular carcinoma by single-cell cytometry and transcriptome sequencing. Adv Sci. 7 (13), 2000224(2020).
  22. Song, J., et al. Protocol for isolating single cells from human pancreatic cancer tissues and analyzing major immune cell populations using flow cytometry. STAR Protoc. 4 (4), 102679(2023).
  23. Simoni, Y., Chng, M. H. Y., Li, S., Fehlings, M., Newell, E. W. Mass cytometry: A powerful tool for dissecting the immune landscape. Curr Opin Immunol. 51, 187-196 (2018).
  24. Comi, M., et al. Coexpression of cd163 and cd141 identifies human circulating il-10-producing dendritic cells (dc-10). Cell Mol Immunol. 17 (1), 95-107 (2020).
  25. Fan, L., et al. High-dimensional single-cell analysis delineates peripheral immune signature of coronary atherosclerosis in human blood. Theranostics. 12 (15), 6809-6825 (2022).
  26. Sheng, J., et al. Human endogenous retrovirus activation contributes to biliary atresia pathogenesis through re-education of resident macrophages. Biorxiv. , (2022).
  27. Terekhova, M., et al. Single-cell atlas of healthy human blood unveils age-related loss of nkg2c(+)gzmb(-)cd8(+) memory t cells and accumulation of type 2 memory t cells. Immunity. 56 (12), 2836-2854.e9 (2023).
  28. Sathaliyawala, T., et al. Distribution and compartmentalization of human circulating and tissue-resident memory t cell subsets. Immunity. 38 (1), 187-197 (2013).
  29. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology. 12 (3), 395(2023).
  30. Iyer, A., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Cytof for the masses. Front Immunol. 13, 815828(2022).
  31. Yuan, X., Wang, J., Huang, Y., Shangguan, D., Zhang, P. Single-cell profiling to explore immunological heterogeneity of tumor microenvironment in breast cancer. Front Immunol. 12, 643692(2021).
  32. Serban, G. M., Mănescu, I. B., Manu, D. R., Dobreanu, M. Optimization of a density gradient centrifugation protocol for isolation of peripheral blood mononuclear cells. Acta Marisiensis - Seria Medica. 64 (2), 83-90 (2018).
  33. Shcherbakova, A., et al. Factors affecting cell viability during the enzymatic dissociation of human endocrine tumor tissues. Biology (Basel). 13 (9), 665(2024).
  34. Devine, R. D., Alkhalaileh, H. S., Lyberger, J. M., Behbehani, G. K. Alternative methods of viability determination in single cell mass cytometry. Cytometry A. 99 (10), 1042-1053 (2021).
  35. Gonzalez, V. D., Huang, Y. W., Fantl, W. J. Mass cytometry for the characterization of individual cell types in ovarian solid tumors. Methods Mol Biol. 2424, 59-94 (2022).
  36. Zabransky, D. J., et al. Profiling of syngeneic mouse hcc tumor models as a framework to understand anti-pd-1 sensitive tumor microenvironments. Hepatology. 77 (5), 1566-1579 (2023).
  37. Levine, L. S., et al. Single-cell analysis by mass cytometry reveals metabolic states of early-activated cd8(+) t cells during the primary immune response. Immunity. 54 (4), 829-844.e5 (2021).
  38. Lv, B., et al. Immunotherapy: Reshape the tumor immune microenvironment. Front Immunol. 13, 844142(2022).
  39. Zhou, Z., et al. Deciphering the tumor immune microenvironment from a multidimensional omics perspective: Insight into next-generation car-t cell immunotherapy and beyond. Mol Cancer. 23 (1), 131(2024).
  40. Hsieh, W. C., et al. Spatial multi-omics analyses of the tumor immune microenvironment. J Biomed Sci. 29 (1), 96(2022).
  41. Wang, Z., et al. Gdf15 induces immunosuppression via cd48 on regulatory t cells in hepatocellular carcinoma. J Immunother Cancer. 9 (9), e002787(2021).
  42. Krams, S. M., Schaffert, S., Lau, A. H., Martinez, O. M. Applying mass cytometry to the analysis of lymphoid populations in transplantation. Am J Transplant. 17 (8), 1992-1999 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Hepatosell ler KarsinomHCCKaraci er Kanserimm n Yan tlarKitle SitometrisiCyTOF Teknolojisimm noterapimm n ManzaraBiyobelirte lerTerap tik Hedeflermm n H cre Pop lasyonlarSistemik Yan tlarLokal Yan tlar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır