JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе изложен метод всестороннего анализа масс-цитометрии (цитометрия по времени пролета [CyTOF]) для оценки как системных, так и местных иммунных реакций при гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК). Этот подход направлен на то, чтобы дать представление об иммунном ландшафте ГЦК, предлагая более глубокое понимание микроокружения опухоли и связанных с ней иммунных механизмов.

Аннотация

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является одной из самых распространенных и смертоносных форм рака печени во всем мире. Несмотря на достижения в лечении, прогноз для пациентов с ГЦК остается плохим из-за сложного взаимодействия генетических, экологических и иммунологических факторов, способствующих ее прогрессированию. Понимание иммунного ландшафта ГЦК имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения, особенно в области иммунотерапии, которая имеет большие перспективы для улучшения результатов лечения пациентов. В этом исследовании используется технология массовой цитометрии (цитометрия по времени пролета [CyTOF]) для изучения как системных, так и местных иммунных реакций у пациентов с ГЦК. Анализируя образцы периферической крови и опухолей, исследование направлено на выявление уникальных популяций иммунных клеток и их функциональных состояний, связанных с прогрессированием ГЦК. Полученные данные дают всесторонний обзор иммунного ландшафта при ГЦК, выделяя потенциальные биомаркеры и терапевтические мишени. Этот подход дает ценную информацию об иммунных механизмах, лежащих в основе ГЦК, и прокладывает путь к разработке более эффективных иммунотерапий для этого злокачественного новообразования.

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является наиболее распространенным первичным раком печени и серьезной проблемой глобального здравоохранения из-за высокой заболеваемости и смертности1. По данным Всемирной организации здравоохранения, ГЦК занимает пятое место среди наиболее распространенных видов рака и вторую по значимости причину смертности от рака во всеммире2. Он особенно распространен в регионах с высокими показателями хронической инфекции гепатита В и С, таких как Восточная Азия и страны Африки к югу от Сахары3. К основным факторам риска относятся вирусный гепатит, цирроз печени и метаболический синдром4. ГЦК требует длительного лечения, что сопряжено со значительным физическим и финансовым бременем, что подчеркивает необходимость эффективной профилактики, раннего выявления и инновационных стратегий лечения5.

Иммунная система играет решающую роль в развитии ГЦК. Печень является иммунологически активным органом с обилием иммунных клеток, в том числе резидентных в печени макрофагов, естественных киллеров (NK) и Т-клеток, которые необходимы для мониторинга и элиминации аномальныхклеток. Тем не менее, ГЦК может уклоняться от иммунного надзора, экспрессируя иммуносупрессивные молекулы, рекрутируя иммуносупрессивные клетки и изменяя микроокружение опухоли 7,8. Этот иммунный побег не только способствует росту опухоли и метастазированию, но и влияет на ответ на иммунотерапию 9,10.

Системные и местные иммунные реакции в микроокружении опухоли являются ключевыми факторами, влияющими на прогрессирование рака и результаты лечения. Системные иммунные реакции включают в себя циркулирующие иммунные клетки, которые могут распознавать и атаковать отдаленные опухолевые клетки, такие как периферические Т-клетки, NK-клетки и моноциты, которые могут нацеливаться на опухолевые клетки по всему организму. Местные иммунные реакции сосредоточены на активности иммунных клеток в опухолевом микроокружении, включая инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TILs), опухолеассоциированные макрофаги (TAMs) и регуляторные Т-клетки (Tregs). В то время как TILs часто оказывают цитотоксическое действие на опухолевые клетки, TAM и Tregs обычно способствуют созданию иммуносупрессивной среды, которая поддерживает рост опухоли11,12. Опухолевые клетки и стромальные клетки могут изменять микроокружение опухоли, способствуя иммуносупрессии и уклоняясь от иммунного надзора. Взаимодействие между системным и местным иммунным ответом определяет общую эффективность противоопухолевого иммунитета11. Понимание этого взаимодействия может помочь в разработке более эффективных стратегий иммунотерапии.

Традиционная проточная цитометрия и иммуногистохимия, хотя и широко используются в иммунологических исследованиях, демонстрируют значительные ограничения, когда дело доходит до анализа сложных иммунных ландшафтов из-за их неспособности выполнять всесторонний анализ с высокой степенью измерения. Проточная цитометрия обладает высокой эффективностью для обнаружения поверхностных и функциональных маркеров на уровне отдельных клеток; Тем не менее, его способность к одновременному анализу нескольких маркеров ограничена, часто ограничена спектральным перекрытием и практическими ограничениями на количество флуоресцентных меток, которые могут быть использованы13,14. Иммуногистохимия, с другой стороны, дает ценную информацию о тканевом контексте конкретных маркеров, но она также затруднена ограниченным числом анализируемых маркеров и неизбежными трудностями получения надежных, количественных, многомерных оценок15.

Для эффективной характеристики сложных иммунных сред необходимы многомерные методы, такие как масс-цитометрия (цитометрия по времени пролета [CyTOF]). Масс-цитометрия — это передовая технология, которая использует масс-спектрометрию для анализа нескольких белковых маркеров в отдельных клетках. Он позволяет проводить многопараметрический анализ отдельных клеток без проблем со спектральным перекрытием, наблюдаемых при традиционной проточной цитометрии16. Используя антитела, помеченные металлом, он может измерять десятки маркеров одновременно, предлагая всестороннее и непредвзятое представление о клеточных фенотипахи функциях. Например, Gadalla et al. разработали панель CyTOF с более чем 40 параметрами для анализа мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) и опухолевой ткани, продемонстрировав ее преимущество в многомерном иммунофенотипировании. Традиционная проточная цитометрия с ее ограниченным числом обнаруживаемых параметров не смогла идентифицировать эти редкие клеточные популяции, демонстрирующие уникальные фенотипы. В отличие от этого, массовая цитометрия позволила всесторонне оценить функциональные состояния этих клеток, обеспечив более подробную и надежную характеристику. Behbehani et al. использовали массовую цитометрию для анализа образцов костного мозга пациентов с миелодиспластическими синдромами (МДС), успешно идентифицировав и охарактеризовав редкие аберрантные гемопоэтические клетки-предшественники18. Способность масс-цитометрии одновременно обнаруживать более 40 поверхностных и внутриклеточных маркеров значительно улучшила обнаружение этих низкочастотных подмножествклеток19. Эти возможности преодолевают традиционные ограничения и обеспечивают более глубокое понимание иммунных ландшафтов, способствуя прогрессу в иммунологии и терапевтических разработках. Возможность всестороннего профилирования клеточных фенотипов и функций на уровне отдельных клеток значительно углубляет понимание иммунологических процессов и помогает в разработке таргетной терапии.

Массовая цитометрия дает всестороннее представление о популяциях системных и локальных иммунных клеток при ГЦК за счет одновременного обнаружения нескольких белковых маркеров. Эта технология позволяет различать различные типы Т-клеток в опухолевом микроокружении, такие как эффекторные Т-клетки, регуляторные Т-клетки (Tregs) и истощенные Т-клетки, выясняя их специфическую роль в опухолевой прогрессии. Используя массовую цитометрию, исследователи могут идентифицировать иммунные маркеры, связанные с прогнозом ГЦК20. Например, субпопуляции Т-клеток с высокой экспрессией белка запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1) могут служить предикторами ответа пациента на ингибиторы иммунных контрольных точек21. Кроме того, он способствует открытию новых терапевтических мишеней за счет идентификации специфических иммуносупрессивных молекул, тем самым обеспечивая основу для персонализированных стратегий лечения. Способность технологии обнаруживать множественные маркеры и ее разрешение для отдельных клеток делают ее особенно выгодной для выявления новых терапевтических мишеней и разработки комбинированной иммунотерапии. Этот передовой подход обладает значительным потенциалом для улучшения результатов лечения у пациентов с ГЦК, предлагая детальное понимание иммунного ландшафта и позволяя разрабатывать индивидуальные терапевтические вмешательства.

Данное исследование направлено на использование масс-цитометрии для анализа профилей системных и местных иммунных клеток пациентов с ГЦК. Цели исследования заключаются в том, чтобы охарактеризовать популяции иммунных клеток, соотнести эти характеристики с клиническими исходами и терапевтическими реакциями, а также определить специфические иммунные маркеры и подмножества клеток, связанные с прогнозом ГЦК. Выясняя роль различных иммунных клеток в ответе на лечение, это исследование стремится обеспечить основу для персонализированных стратегий лечения. Ожидается, что полученные результаты оптимизируют существующую иммунотерапию и предоставят ценную информацию для разработки новых методов лечения, в конечном итоге направленных на улучшение общей выживаемости и качества жизни пациентов с ГЦК.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Этапы сбора образцов крови и ГЦК, выделения мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ), диссоциации одиночных клеток и окрашивания изложены в следующем плане. Все экспериментальные реактивы и материалы перечислены в Таблице материалов. Все эксперименты проводились с одобрения Комитета по этике Первой аффилированной больницы Школы медицины Чжэцзянского университета, что гарантировало, что сбор образцов опухоли не помешает патологической диагностике. Письменное информированное согласие было получено от всех людей.

1. Изоляция МПМП

  1. Возьмите образец крови из вены пациентов с ГЦК и используйте пробирку, наполненную антикоагулянтом, чтобы предотвратить свертывание крови. Образцы крови были получены от 4 пациентов (2 мужчины и 2 женщины) в возрасте 50-60 лет, средний возраст которых составил 55 лет. Для каждого пациента необходимо собрать 10-20 мл периферической крови, чтобы обеспечить достаточный объем для последующей изоляции ПМК при минимизации дискомфорта пациента.
  2. Наберите определенный объем крови (например, 6 мл) и добавьте равный объем жидкости для разделения лимфоцитов периферической крови (Ficol-paque или Lymphoprep) в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем в идеале не должен превышать 12 мл, чтобы обеспечить пространство для надлежащего смешивания и предотвратить переполнение; максимальный рекомендуемый объем для центрифужной пробирки объемом 15 мл составляет 14 мл.
  3. Наклоните центрифужную пробирку под углом 45° и медленно добавляйте кровь вдоль стенки пробирки, осторожно медленно выкладывая кровь поверх жидкости для разделения лимфоцитов периферической крови, чтобы избежать смешивания двух слоев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью пипетки можно медленно добавлять кровь вдоль стенки трубки.
  4. Поместите трубку центрифуги в центрифугу и установите ускорение на 8 и замедление на 3. Центрифуга при 450 x g, 4 °C, в течение 30 минут. После центрифугирования в пробирке формируются 4 слоя, сверху вниз: плазменный слой, слой PBMCs (слой белой мембраны), слой Фикола-Паке, а также слой эритроцитов и гранулоцитов.
  5. С помощью пипетки аккуратно соберите слой PBMCs в новую стерильную центрифужную пробирку. Добавьте в 3 раза больше объема PBS и центрифугируйте при 500 x g при 4°C в течение 5 минут. После центрифугирования на дне пробирки формируется гранула.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, добавьте 1 мл 2% буферизованного физиологического раствора фетальной бычьей сыворотки (FBS-PBS) для ресуспендирования клеток, а затем добавьте 3 мл буфера для лизиса эритроцитов (RBC). Центрифуга при 500 x g при 4°C в течение 5 мин.
  7. Убедитесь, что на дне пробирки нет эритроцитов, указывающих на то, что эритроциты были полностью лизированы. Повторно суспендируйте клетки в 2% FBS-PBS и приступайте непосредственно к последующим экспериментам или добавьте раствор для криоконсервации клеток и храните при температуре -80°C в течение 2-3 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве общей рекомендации, для ресуспензии используйте 0,5 мл 2% FBS-PBS на 1 x 106 клеток. Количество клеток определяется с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток после окрашивания трипановым синим, чтобы отличить живые клетки от мертвых. Такое соотношение помогает обеспечить оптимальное восстановление и жизнеспособность клеток во время последующих процедур.

2. Выделение клеток опухолевой ткани

Примечание: Метод выделения клеток опухолевой ткани был адаптирован из Song et al.22.

  1. После резекции ГЦК под руководством патологоанатома с помощью стерильного скальпеля иссекают часть опухолевой ткани. Тканевый блок должен быть размером примерно 1 см3 дюйма. Смойте любые поверхностные пятна с помощью предварительно охлажденного 1x PBS. Погрузите ткань в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую около 5 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS. Поместите пробирку на лед и транспортируйте ее обратно в лабораторию для дальнейшей обработки.
  2. Тщательно смойте пятна крови и вручную удалите жировую ткань с помощью щипцов, чтобы обеспечить полную очистку тканей с помощью предварительно охлажденного 2% FBS-PBS. Перенесите ткань в обработанную тканью чашку, содержащую раствор для пищеварения. Закрепите опухолевую ткань щипцами и разрежьте ее на кусочки размером менее 1 мм3 скальпелем. Перелейте раствор для разложения тканей в центрифужную пробирку объемом 50 мл, добавляя еще раствор для разложения тканей, пока общий объем не составит примерно 15 мл.
  3. Поместите центрифужную трубку, содержащую смесь для разложения тканей, в шейкер. Наклоните или расплющите его и закрепите для пищеварения при 150 об/мин и 37 °C в течение 1 часа. Отфильтруйте раствор для сбраживания через фильтр 70 мкм.
    1. Во время этой процедуры с помощью поршня шприца объемом 1 мл измельчите фрагменты ткани. Промойте фильтр 2% раствором FBS-1640. Возьмите фильтрат и переложите его в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
  4. Центрифугируйте фильтрат при давлении 500 x g в течение 5 минут при 4 °C. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость. Осторожно повторно суспендируйте гранулу примерно в 10 мл 36% раствора Percoll. Затем снова центрифугируйте его при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  5. Осторожно отасуньте 1 мл буфера для лизиса эритроцитов с помощью пипетки, чтобы ресуспендировать клеточную суспензию. Переложите суспензию в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте буфер для лизиса эритроцитов, чтобы общий объем составил 10 мл. Дайте смеси настояться при комнатной температуре в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Новая центрифужная трубка используется для предотвращения повторного попадания любых примесей на стенке пробирки в клеточную суспензию, тем самым снижая риск снижения выхода клеток.
  6. Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C, затем повторно суспендируйте клетки в соответствующем объеме 2% FBS-PBS. В качестве общей рекомендации, используйте 0,5 мл 2% FBS-PBS на 1 x 106 клеток для ресуспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток определяется с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток после окрашивания трипановым синим, чтобы отличить живые клетки от мертвых. Объем ресуспензии зависит от необходимого количества клеток для последующих экспериментов. Такое соотношение помогает обеспечить оптимальное восстановление и жизнеспособность клеток во время последующих процедур.

3. Окрашивание цисплатином

  1. Возьмите 3 x 106 клеток из PBMC, полученных на шаге 1.7, и опухолевые клетки, выделенные на шаге 2.6, соответственно. После восстановления клеток ресуспендируйте их в 1 мл PBS без Ca2+ и Mg2+. Добавьте цисплатин до конечной концентрации 0,5 μМ, хорошо перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание цисплатином проводится для отличия мертвых клеток от живых на основе целостности мембраны. Мертвые клетки с поврежденными мембранами будут поглощать цисплатин и показывать положительный сигнал, в то время как живые клетки остаются неокрашенными. Количество ячеек должно быть не менее 1 х 106.
  2. Центрифугируйте пробирки при давлении 500 х г в течение 5 минут при комнатной температуре, выбросьте надосадочную жидкость, затем добавьте 1 мл буфера для окрашивания клеток в каждую пробирку, содержащую клеточные суспензии, приготовленные на шаге 3.1, чтобы остановить реакцию. Центрифугируйте при давлении 500 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, выбросьте надосадочную жидкость и убедитесь, что клеточная гранула не распределяется линейно вдоль стенки пробирки после центрифугирования.

4. Блокировка Fc-рецепторов

  1. Заранее приготовьте блочную смесь объемом 50 мкл для каждого образца: смешайте 48 мкл буфера для окрашивания клеток, затем добавьте 2 мкл раствора для блокирования клеток (буфер для окрашивания клеток: раствор для блокирования клеток = 9:1).
  2. Подвесьте клетки с шага 3.2 в вышеуказанную смесь и дайте им постоять при комнатной температуре в течение 10 минут.

5. Инкубация антител к мембранному белку

  1. Для каждого образца клетки, полученного на шаге 4.2, готовят смесь антител к мембранному белку, добавляя по 1,1 мкл единиц каждого антитела. Затем добавьте буфер для окрашивания клеток, чтобы конечный объем составил 55 мкл. На этом этапе общий объем составляет примерно 100 μл.
    Смесь включает антитела, нацеленные на ключевые мембранные белки, такие как CD163, CCR3, CD141, CD117 и CD4524,25. Эти антитела были отобраны с учетом их специфичности в идентификации мембранных белковых маркеров и получены из коммерчески доступных источников (подробнее см. в Таблице материалов, включая номера клонов, производителей и каталожные номера).
  2. Добавьте 50 мкл приготовленной смеси антител в каждый образец пробирки, доведите общий объем до 100 мкл. Аккуратно взболтайте образцы и инкубируйте их при комнатной температуре в течение 15 мин.
  3. Добавьте 2 мл буфера для окрашивания клеток в каждый образец, центрифугируйте при 500 x g в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг 2 раза.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость и кратковременно смешайте оставшуюся жидкость с клеточной гранулой для ресуспендирования и тщательного диспергирования клетки.

6. Окрашивание белков ядра

  1. После того, как клетки будут полностью ресуспендированы, добавьте 500 мкл смешанного раствора (фиксация: фиксация/пермеабилизация = 3:1) в каждый образец из шага 5.4. Аккуратно перемешайте образцы и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.
  2. Разбавьте буфер для пермеабилизации (10x) деионизированной водой. После инкубации центрифугировать при 500 г в течение 5 мин при комнатной температуре и выбросить надосадочную жидкость. Добавьте 1000 мкл 1x пермеабилизационного буфера в каждую пробирку, чтобы промыть клетки. Центрифугируйте при комнатной температуре 1000 x g в течение 5 минут, затем выбросьте надосадочную жидкость.
  3. Ресуспендируйте антитела в 1-кратном буфере для пермеабилизации. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 50 мкл смеси антител в каждую пробирку клеток. Аккуратно пипеткой перемешайте клетки, затем инкубируйте при комнатной температуре в течение 30-45 минут.
  4. Добавьте 1000 мкл 1x пермеабилизационного буфера в каждую пробирку, центрифугируйте при комнатной температуре при 1000 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Добавьте 1000 μL буфера для окрашивания клеток в каждую пробирку, чтобы снова суспендировать клетки, центрифугируйте при комнатной температуре при 1000 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.

7. Фиксация клеток

  1. Приготовьте 1,6% раствор формальдегида в PBS, из расчета 1 мл на образец.
  2. Добавьте 1 мл 1,6% раствора формальдегида в каждый образец с шага 6.5, вортоком тщательно перемешайте и выдержите при комнатной температуре в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как формальдегид обычно используется для фиксации клеток, также можно использовать альтернативные реагенты, такие как 4% параформальдегид (PFA) или метанол. Выбор фиксатора должен основываться на конкретных требованиях эксперимента и клеточных особенностях, которые необходимо наблюдать.
  3. Центрифугируйте при комнатной температуре 800 х г в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.

8. Окрашивание ядерной интеркаляцией

  1. Приготовьте раствор для интеркаляции клеток: Разбавьте Cell-ID Intercalator-Iridium (Ir) с Fix и буфером для пермеабилизации до конечной концентрации 125 нМ. Приготовьте 1 мл раствора на образец.
  2. Добавьте 1 мл приготовленного раствора для интеркаляции клеток в каждый фиксированный образец, начиная с шага 7.3. Аккуратно перемешайте и сразу же перемешайте. Это помогает свести к минимуму образование клеточных агрегатов.
  3. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч или при 4°C в течение ночи. Центрифугируйте при 500 г в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.

9. Приготовление клеточной суспензии

  1. Добавьте в пробирку 1000 μL буфера для окрашивания клеток, начиная с шага 8.3, и центрифугируйте при 800 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг 2 раза.
  2. Добавьте 450 мкл к 900 мкл деионизированной воды для ресуспендирования клеток. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток после окрашивания трипановым синим. После подсчета приступают к сбору и анализу данных с помощью масс-цитометрии.

10. Масс-цитометрия и анализ данных

  1. Получение данных массовой цитометрии с помощью системы CyTOF и сохранение их в виде файлов стандарта проточной цитометрии (FCS). Обеспечьте надлежащую калибровку прибора и контроль качества для снижения фонового шума и эффектов партии в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Предварительная обработка популяции клеток CD45+ в файле FCS с помощью соответствующего программного обеспечения. Удаляйте мусор в зависимости от размера ячейки (прямое рассеяние, FSC) и зернистости (боковое рассеивание, SSC). Исключение дублетов путем последовательного стробирования графиков FSC-A/FSC-H или SSC-A/SSC-H. Удалите мертвые клетки с помощью окрашивания на жизнеспособность, такого как исключение цисплатина. Gate the CD45+ population, чтобы сосредоточиться на иммунных клетках и экспортировать закрытую популяцию для дальнейшего анализа.
  3. Преобразуйте данные с помощью кофактора, равного 5, и определите основные кластеры с помощью программного обеспечения для кластеризации. Выполнение кластеризации на основе алгоритма SPADE (SPADE) для анализа прогрессии прогрессии по шкале плотности (SPADE), который группирует ячейки с аналогичными профилями экспрессии маркеров в кластеры26. Использование иерархического стохастического встраивания соседей (HSNE) для уменьшения размерности и идентификации отдельных кластеров26.
  4. Выполните повторную кластеризацию основных кластеров с помощью пакета cytofkit в программном обеспечении R для кластеризации без учителя. Идентифицируйте подкластеры с помощью PhenoGraph с помощью параметров по умолчанию.
  5. Примените равномерную аппроксимацию и проекцию многообразия (UMAP) для уменьшения размерности. Проведите статистический анализ с помощью теста Вилкоксона, считая P-значение < 0,05 статистически значимым. Визуализируйте результаты с помощью ggplot2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для выяснения иммунологических характеристик, ассоциированных с ГЦК, был проведен комплексный анализ популяций иммунных клеток. У 4 пациентов с ГЦК были собраны парные образцы тканей PBMC и HCC. Масс-цитометрическое профилирование проводилось для изуч?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом исследовании используется технология массовой цитометрии для обеспечения глубокого анализа как системных, так и местных иммунных реакций при ГЦК. Применение масс-цитометрии в этом контексте позволяет одновременно обнаруживать несколько маркеров на уровне о?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (грант 2019YFA0803000 J.S.), Фондом отличной молодежи Zhejiang Scientific (грант R22H1610037 J.S.), Национальным фондом естественных наук Китая (грант 82173078 J.S.), Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (грант 2022C03037 J.S.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1×PBSHyCloneSH30256.01
10×PBSHyCloneSH30256.01
100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dishCorning430167
1000 mL pipette tipsRainin30389218
15 mL centrifuge tubeNEST601052
200 mL pipette tipsRainin30389241
40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainerFalcon352340
50 mL centrifuge tubeNEST602052
70 μm syringe fifilterSangon BiotechF613462-9001
Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)BioLegend357224
Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)BioLegend310724
Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)BioLegend353240
Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)BioLegend350202
Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)BioLegend347314
Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)BioLegend313201
Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) BD562721
Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) BD563026
Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)BioLegend306002
Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)BioLegend351337
Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)BioLegend301701
Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)BioLegend356535
Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)BioLegend325604
Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)BioLegend344102
Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)BioLegend376302
Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) BD561313
Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)BioLegend339902
Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)BioLegend333603
Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)BioLegend346002
Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)BioLegend302226
Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)BioLegend331501
Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)BioLegend302301
Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)BioLegend321151
Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)BioLegend311129
Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)BioLegend302624
Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) BD555916
Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)BioLegend375902
Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)BioLegend303232
Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)BioLegend369812
Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)BioLegend303402
Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) BD563094
Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) BD563716
Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)BioLegend304220
Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)BioLegend362510
Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)BioLegend399502
Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)BioLegend392917
Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)BioLegend333808
Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)BioLegend310902
Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)BioLegend395602
Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) BD557750
Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)BioLegend375402
Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)BioLegend374202
Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)BioLegend320101
Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)BioLegend311426
Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)BioLegend307650
Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)BioLegend348211
Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)BioLegend350501
Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)BD567783
Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)BioLegend329951
Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)BioLegend393602
Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) BD740415
Cell cryopreservation solutionThermo FisherA2644601
Cell-lD CisplatinStandard BioTools201064
Cell-lD Intercalator-lrStandard BioTools201192A
Collagenase, Type IVGibco17104019
Constant-temperature shakeFAITHFULFS-50B
CyTOF SystemFluidigm CorporationHelios
CytosploreCytosplore Consortium2.3.1
Dispase IIGibco17105041
DNase IMerckDN25
Eppendorf centrifugeEppendorf5702
EQ Four Element Calibration BeadsStandard BioTools201078
FBSGibco16000-044
Ficoll-paqueCytiva17-1440-02
FinnpipetteThermo Scientific4700870
Fixation bufferThermo ScientificFB001
FlowJoBD Life Sciences10.1
Formaldehyde solutionThermo Scientific28906
Granzyme B Antibody, anti-human/mouse (clone: QA16A02)BioLegend396413
Heparin TubesBD367874
Human BD Fc Block 2.5 mg/mLBD564220
MACS Tissue Storage SolutionMiltenyi130-100-008
Maxpar Fix and Perm BufferStandard BioTools201067
Maxpar metal-coniugated antibodiesStandard BioToolsVarious
Maxpar PBSStandard BioTools201058
Maxpar WaterStandard BioTools201069
Maxpare Cell Staining BufferStandard BioTools201068
Metal-conjugated Anti-Human α-SMA Antibody (clone: 1A4)Miltenyi Biotec130-098-145
PercollMerckP4937-500ML
Permeabilization bufferThermo Scientific00833356
RBC lysis bufferBD555899
Refrigerated centrifugeEppendorf5910ri
RPMI 1640 medium GE HealthCareSH30027.0
ScalpelAPPLYGENTB6298-1
Sterile Pasteur pipetteZDANZD-H03
Tissue digestion solutionYeasen Biotech41423ES30
Tuning SolutionStandard BioTools201072
Vortex MixerThermo Scientific88882012

Ссылки

  1. Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia. Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).
  2. Renne, S. L., et al. Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview. Pathologica. 113 (3), 203-217 (2021).
  3. Sayiner, M., Golabi, P., Younossi, Z. M. Disease burden of hepatocellular carcinoma: A global perspective. Dig Dis Sci. 64 (4), 910-917 (2019).
  4. Zhang, X., et al. Risk factors and prevention of viral hepatitis-related hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 11, 686962(2021).
  5. Zou, H., et al. Economic burden and quality of life of hepatocellular carcinoma in greater China: A systematic review. Front Public Health. 10, 801981(2022).
  6. Li, Y., You, Z., Tang, R., Ma, X. Tissue-resident memory t cells in chronic liver diseases: Phenotype, development and function. Front Immunol. 13, 967055(2022).
  7. Shen, K. Y., Zhu, Y., Xie, S. Z., Qin, L. X. Immunosuppressive tumor microenvironment and immunotherapy of hepatocellular carcinoma: Current status and prospectives. J Hematol Oncol. 17 (1), 25(2024).
  8. Oura, K., Morishita, A., Tani, J., Masaki, T. Tumor immune microenvironment and immunosuppressive therapy in hepatocellular carcinoma: A review. Int J Mol Sci. 22 (11), 5801(2021).
  9. Chen, Y., et al. Effect of infiltrating immune cells in tumor microenvironment on metastasis of hepatocellular carcinoma. Cell Oncol. 46 (6), 1595-1604 (2023).
  10. Du, Q., An, Q., Zhang, J., Liu, C., Hu, Q. Unravelling immune microenvironment features underlying tumor progression in the single-cell era. Cancer Cell Int. 24 (1), 143(2024).
  11. Xu, L., et al. Reshaping the systemic tumor immune environment (stie) and tumor immune microenvironment (time) to enhance immunotherapy efficacy in solid tumors. J Hematol Oncol. 15 (1), 87(2022).
  12. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 131(2021).
  13. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: Visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  14. Sahaf, B., Rahman, A., Maecker, H. T., Bendall, S. C. Biomarkers for immunotherapy of cancer: Methods and protocols. , Springer. New York, New York, NY. (2020).
  15. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8 (6), e68519(2013).
  16. Wu, K., et al. Redefining tumor-associated macrophage subpopulations and functions in the tumor microenvironment. Front Immunol. 11, 1731(2020).
  17. Elaldi, R., et al. High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture. Front Immunol. 12, 666233(2021).
  18. Gadalla, R., et al. Validation of cytof against flow cytometry for immunological studies and monitoring of human cancer clinical trials. Front Oncol. 9, 415(2019).
  19. Ijsselsteijn, M. E., Van Der Breggen, R., Farina Sarasqueta, A., Koning, F., De Miranda, N. A 40-marker panel for high dimensional characterization of cancer immune microenvironments by imaging mass cytometry. Front Immunol. 10, 2534(2019).
  20. Zhang, Q., et al. Mass cytometry-based peripheral blood analysis as a novel tool for early detection of solid tumours: A multicentre study. Gut. 72 (5), 996-1006 (2023).
  21. Zheng, B., et al. Trajectory and functional analysis of pd-1(high) cd4(+)cd8(+) t cells in hepatocellular carcinoma by single-cell cytometry and transcriptome sequencing. Adv Sci. 7 (13), 2000224(2020).
  22. Song, J., et al. Protocol for isolating single cells from human pancreatic cancer tissues and analyzing major immune cell populations using flow cytometry. STAR Protoc. 4 (4), 102679(2023).
  23. Simoni, Y., Chng, M. H. Y., Li, S., Fehlings, M., Newell, E. W. Mass cytometry: A powerful tool for dissecting the immune landscape. Curr Opin Immunol. 51, 187-196 (2018).
  24. Comi, M., et al. Coexpression of cd163 and cd141 identifies human circulating il-10-producing dendritic cells (dc-10). Cell Mol Immunol. 17 (1), 95-107 (2020).
  25. Fan, L., et al. High-dimensional single-cell analysis delineates peripheral immune signature of coronary atherosclerosis in human blood. Theranostics. 12 (15), 6809-6825 (2022).
  26. Sheng, J., et al. Human endogenous retrovirus activation contributes to biliary atresia pathogenesis through re-education of resident macrophages. Biorxiv. , (2022).
  27. Terekhova, M., et al. Single-cell atlas of healthy human blood unveils age-related loss of nkg2c(+)gzmb(-)cd8(+) memory t cells and accumulation of type 2 memory t cells. Immunity. 56 (12), 2836-2854.e9 (2023).
  28. Sathaliyawala, T., et al. Distribution and compartmentalization of human circulating and tissue-resident memory t cell subsets. Immunity. 38 (1), 187-197 (2013).
  29. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology. 12 (3), 395(2023).
  30. Iyer, A., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Cytof for the masses. Front Immunol. 13, 815828(2022).
  31. Yuan, X., Wang, J., Huang, Y., Shangguan, D., Zhang, P. Single-cell profiling to explore immunological heterogeneity of tumor microenvironment in breast cancer. Front Immunol. 12, 643692(2021).
  32. Serban, G. M., Mănescu, I. B., Manu, D. R., Dobreanu, M. Optimization of a density gradient centrifugation protocol for isolation of peripheral blood mononuclear cells. Acta Marisiensis - Seria Medica. 64 (2), 83-90 (2018).
  33. Shcherbakova, A., et al. Factors affecting cell viability during the enzymatic dissociation of human endocrine tumor tissues. Biology (Basel). 13 (9), 665(2024).
  34. Devine, R. D., Alkhalaileh, H. S., Lyberger, J. M., Behbehani, G. K. Alternative methods of viability determination in single cell mass cytometry. Cytometry A. 99 (10), 1042-1053 (2021).
  35. Gonzalez, V. D., Huang, Y. W., Fantl, W. J. Mass cytometry for the characterization of individual cell types in ovarian solid tumors. Methods Mol Biol. 2424, 59-94 (2022).
  36. Zabransky, D. J., et al. Profiling of syngeneic mouse hcc tumor models as a framework to understand anti-pd-1 sensitive tumor microenvironments. Hepatology. 77 (5), 1566-1579 (2023).
  37. Levine, L. S., et al. Single-cell analysis by mass cytometry reveals metabolic states of early-activated cd8(+) t cells during the primary immune response. Immunity. 54 (4), 829-844.e5 (2021).
  38. Lv, B., et al. Immunotherapy: Reshape the tumor immune microenvironment. Front Immunol. 13, 844142(2022).
  39. Zhou, Z., et al. Deciphering the tumor immune microenvironment from a multidimensional omics perspective: Insight into next-generation car-t cell immunotherapy and beyond. Mol Cancer. 23 (1), 131(2024).
  40. Hsieh, W. C., et al. Spatial multi-omics analyses of the tumor immune microenvironment. J Biomed Sci. 29 (1), 96(2022).
  41. Wang, Z., et al. Gdf15 induces immunosuppression via cd48 on regulatory t cells in hepatocellular carcinoma. J Immunother Cancer. 9 (9), e002787(2021).
  42. Krams, S. M., Schaffert, S., Lau, A. H., Martinez, O. M. Applying mass cytometry to the analysis of lymphoid populations in transplantation. Am J Transplant. 17 (8), 1992-1999 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

CyTOF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены