Técnicas de patch-clamp para el análisis de vesículas endolisosomales únicas

Resumen

Este protocolo detalla un método para medir directamente la actividad de los canales iónicos en vesículas intracelulares utilizando un sistema manual de pinza de parche endolisosomal. Ilustramos el método que consiste en agrandar los endolisosomas y aislar manualmente estas vesículas. Este enfoque garantiza que los investigadores puedan replicar y aplicar con precisión el procedimiento.

Resumen

Los canales iónicos endolisosomales son fundamentales para la homeostasis de iones y pH endolisosomales, la regulación del potencial de membrana y el tráfico de vesículas. Sin embargo, el acceso electrofisiológico a estos canales dentro de pequeñas vesículas intracelulares ha sido un desafío. El desarrollo de las técnicas endolisosomales de patch-clamp ha sido fundamental para superar esta barrera, permitiendo la medición directa de la actividad de los canales iónicos en las membranas endolisosomales.

En comparación con las técnicas de patch-clamp planas, la patch-clamp endolisosomal puede registrar simultáneamente varias células y combinarse fácilmente con otros métodos de medición. La operación manual ofrece la ventaja de visualizar vesículas específicas. También aborda la limitación de la presencia indispensable de Ca²⁺ en un lado de la membrana endolisosomal, aumentando la flexibilidad del diseño experimental. El uso de técnicas endolisosomales de patch-clamp permite la medición y el análisis directos de la actividad de los canales iónicos dentro de los endolisosomas.

Dado el estrecho vínculo entre la función aberrante de los canales iónicos endolisosomales y enfermedades como las enfermedades neurodegenerativas y los trastornos metabólicos, la investigación y modulación de estos canales puede revelar nuevas dianas farmacológicas. Al restaurar el equilibrio iónico intracelular, podemos aliviar o curar enfermedades relacionadas. Por lo tanto, esta técnica es fundamental para descubrir nuevas dianas farmacológicas y desarrollar medicamentos relevantes.

Introducción

Los canales iónicos juegan un papel crucial en numerosos procesos fisiológicos. Si bien los canales iónicos de superficie han recibido una atención significativa, la importancia de los canales intracelulares, particularmente los que se encuentran dentro de los endolisosomas, se está reconociendo gradualmente. El sistema endolisosomal está compuesto por orgánulos multifuncionales unidos a la membrana especializados en funciones celulares fundamentales, incluidos los endosomas de reciclaje (RE), los endosomas tempranos (EE), los endosomas tardíos (LE), los lisosomas (LY) y los orgánulos híbridos con características endolisosomales y de otros compartimentos, como fagosomas y autofagosomas.

Los EE, también conocidos como endosomas de clasificación (SE), son uno de los primeros destinos de los materiales internalizados de la membrana plasmática (PM). Los EE son compartimentos críticos responsables de clasificar la carga en varias vías endocíticas, como la vía de maduración a LE/LY para la degradación, la vía de reciclaje rápido de regreso al PM y la vía de reciclaje lento que involucra el compartimiento de reciclaje o RE periférico. Los cuerpos multivesiculares (MVB) derivados de los endosomas son compartimentos esféricos rodeados por una membrana limitante, que puede llenarse de vesículas intraluminales (ILVs)¹. Para mantener la función normal de estos orgánulos, requieren canales iónicos de membrana para regular el pH vesicular, la osmolaridad y la transducción de señales. Sin embargo, medir la actividad de estos canales no es sencillo.

Para los canales iónicos ubicados en la membrana plasmática, la técnica de patch-clamp desarrollada en la década de 1970 ha sido durante mucho tiempo el método estándar^{de oro 2}. Sin embargo, el acceso electrofisiológico a los canales dentro de pequeñas vesículas intracelulares sigue siendo un desafío. La aplicación del estándar de oro para medir los canales iónicos de la membrana plasmática a los de los orgánulos intracelulares se enfrenta a tres retos principales. En primer lugar, el tamaño de los endolisosomas suele ser muy pequeño (menos de 1 μm de diámetro), lo que dificulta su observación y aislamiento al microscopio y es más pequeño que el diámetro de apertura de las micropipetas de vidrio típicas, lo que hace que el experimento sea inoperable. En segundo lugar, aislar los endolisosomas directamente de las células diana mientras se mantiene la integridad de los orgánulos requiere habilidades especiales. En tercer lugar, debido a la ausencia de un citoesqueleto en los orgánulos intracelulares, la formación de un sello en la membrana endolisosomal dentro de la pipeta de parche y luego romperla para lograr una configuración endolisosoma completa puede ser un desafío, ya que compromete la integridad estructural del orgánulo³.

Se han desarrollado varios métodos para superar estos problemas, incluido el registro de bicapas lipídicas, la modificación de las secuencias de orientación lisosomal y las técnicas de electrofisiología basadas en membranas sólidas (SSM o SSME). El método de registro de bicapas lipídicas consiste en la reconstrucción de membranas de fosfolípidos sintéticos con canales iónicos purificados, lo que permite un estudio electrofisiológico detallado de la función de las proteínas de membrana en condiciones controladas ^4,5. La modificación de las secuencias de diana lisosomal en los canales iónicos implica la redirección de los canales iónicos endolisosomales a la membrana plasmática para su medición mediante métodos convencionales de patch-clamp⁶. Las técnicas de electrofisiología basadas en membranas sólidas (SSM o SSME), también conocidas como el método de fijación de parches planos endolisosomales, utilizan virutas de vidrio planas de sustrato sólido con aberturas pequeñas (<1 μm de diámetro) en virutas de borosilicato planas microestructuradas. Estos chips de vidrio de pequeña apertura permiten el análisis de endolisosomas pequeños, incluso nativos, utilizando un sistema de control de presión-succión (Nanion). Sin embargo, en los dos primeros métodos, los canales iónicos no están en su entorno fisiológico natural. Los intentos de registrar los canales lisosomales expresados en la membrana plasmática o reconstituidos en bicapas lipídicas han producido en gran medida resultados inciertos y contradictorios.

Aunque las técnicas planas de fijación de parches han abordado eficazmente el problema de la interferencia artificial y ofrecen la ventaja de mediciones de alto rendimiento, las soluciones utilizadas también están limitadas por este método. La técnica endolisosomal de patch-clamp introducida en este artículo puede registrar simultáneamente varias células y combinarse fácilmente con otros métodos de medición. La operación manual proporciona la ventaja de visualizar las vesículas objetivo. También supera la inevitable limitación de Ca²⁺ en la solución en un lado de la membrana endolisosomal, aumentando la libertad del diseño experimental³. Recientemente, las técnicas endolisosomales de patch-clamp han desempeñado un papel clave en la investigación del desarrollo de fármacos. Por ejemplo, en enfermedades neurodegenerativas, esta técnica ha ayudado a identificar nuevos fármacos dirigidos a los canales iónicos endolisosomales asociados a las enfermedades de Alzheimer y Parkinson ^7,8. Los investigadores también pueden utilizar esta técnica para explorar el papel de los canales iónicos endolisosomales en las células tumorales⁹, controlando así el crecimiento y la proliferación tumoral. En cuanto a las enfermedades metabólicas, los estudios endolisosomales están revelando compuestos que regulan los canales iónicos endolisosomales, ofreciendo nuevos enfoques de tratamiento para la diabetes y la obesidad. La técnica endolisosomal de patch-clamp ayuda a comprender la disfunción endolisosomal y a encontrar posibles terapias⁶, mejorando significativamente nuestra comprensión de las funciones de los canales iónicos endolisosomales y promoviendo el descubrimiento de nuevas dianas farmacológicas.

Protocolo

1. Configuración del instrumento

1. Hardware
   NOTA: Consulte la Figura 1 para ver una configuración estándar de un equipo de electrofisiología.
   1. Proteja la configuración de interferencias externas con una mesa y una jaula de Faraday.
   2. Utilice un microscopio invertido con un micromanipulador para posicionar el microelectrodo de manera estable.
   3. Configure un amplificador para recoger y amplificar las señales adquiridas.
   4. Utilice un digitalizador para convertir las señales analógicas en señales digitales.
   5. Utilice el software de adquisición y análisis de datos para establecer protocolos experimentales y extraer resultados significativos y analizables de los datos recopilados.
2. Electrodos
   1. Utilice dos electrodos: un electrodo de baño y un electrodo de pipeta.
      NOTA: El platino y el cloruro de plata tienen las mejores propiedades de polarización. Los electrodos de cloruro de plata consisten en alambre o gránulos de plata que han sido clorados, por lo que tienen una capa de AgCl en la superficie externa del alambre o pellet (Figura 2).
3. Preparación de pipetas
   1. Tirando
      1. Instale el tubo capilar en el extractor.
         NOTA: Los parámetros utilizados para la fabricación de pipetas a continuación son específicos del instrumento. El instrumento que utilizamos en este trabajo se menciona en la Tabla de Materiales.
      2. En condiciones experimentales (temperatura ambiente 22 °C, filamento calefactor de forma pasante, vidrio de borosilicato con filamento) que no quemen el filamento del calentador, realice una prueba RAMP en el extractor para determinar el valor calorífico (CALOR) necesario para derretir el capilar de vidrio.
      3. Diseñe un nuevo programa de tracción con seis ciclos de tracción separados utilizando los parámetros HEAT, velocidad (VEL) y tiempo (TIME) (Tabla 1).
         NOTA: CALOR se refiere al parámetro que calienta el filamento del calentador, permitiendo que el filamento de vidrio se derrita. La velocidad indica la velocidad a la que el tirador tira del filamento en ambas direcciones. El tiempo representa la duración del intervalo entre cada ciclo.
      4. Presione el botón verde Pull en el teclado.
      5. Afloje la perilla de sujeción y retire las pipetas del extractor.
      6. Inspeccione las puntas de pipeta debajo del ocular de la microforja para determinar el diámetro de la punta, la nitidez y la geometría. Asegúrese de que el diámetro de la punta sea de 0,5-0,9 μm.
         NOTA: A medida que el filamento se usa con más frecuencia, el valor calorífico requerido para derretir el capilar de vidrio cambiará.
      7. Si el tamaño de la punta no cumple con las expectativas, ajuste los parámetros HEAT y VEL. Las temperaturas más altas y las velocidades más rápidas producirán puntas más finas y largas, y viceversa. Ajuste el calor en incrementos de 5 grados y la velocidad en incrementos de 3.
   2. Pulido
      1. Coloque las pipetas de parche extraídas en el soporte de microforge.
      2. Inspeccione las puntas de pipeta con una lente de objetivo de 35x (combinada con un ocular de 15x, lo que da como resultado un aumento de 525x ).
      3. Utilice el micromanipulador para acercar las pipetas de parche al filamento.
      4. Coloque el dial de temperatura en 80.
      5. Utilice el interruptor de pedal para encender el calentador y aplique un breve pulso de calor (1 - 2 s), controlando el proceso de pulido a través del ocular microforge.
      6. Repita el proceso hasta que todas las pipetas estén pulidas.
      7. Coloque las pipetas terminadas en una caja sellada para evitar que entre polvo.
         NOTA: El objetivo es derretir rápidamente la punta para que el vidrio reforme la geometría final de la punta sin hacerla demasiado afilada. Esto evita que la pipeta penetre en la membrana de la vesícula contra la que se presiona y promueve eficazmente la formación de sellos. Tras el pulido final, el recorrido interior de la punta de la pipeta debe ser muy estrecho, recto y lineal.
         Las mejores pipetas de grabación suelen tener una resistencia de 5 a 8 MΩ después del pulido al fuego. El diámetro de la abertura de la punta debe ser de 2 μm. Una pipeta de parche perfectamente pulida es esencial para el éxito de la formación de gigaseal, ya que esta es una de las técnicas clave cruciales para el éxito del procedimiento.

2. Preparación de la muestra

1. Cultivo celular (usando HEK293 como ejemplo)
   1. Cultive las células en una incubadora humidificada estándar a 37 °C con 5% de CO₂.
   2. Cultivo de las células HEK293 en DMEM de baja glucosa suplementado con suero fetal bovino (FBS) 10% inactivado por calor, 100 U/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina.
   3. Coloque cubreobjetos de 12 mm recubiertos de poli-L-lisina en una placa de 24 pocillos.
2. Aumento de orgánulos
   1. Agregue 1 μM de vacuolina-1 a las células HEK293 en la placa de 24 pocillos (del paso 2.1) e incube a 37 °C con 5% de CO₂ durante la noche hasta que comiencen a formarse vesículas agrandadas.
      NOTA: El tamaño de los endolisosomas agrandados puede alcanzar 1-10 μm, dependiendo de la herramienta, el compuesto, el tiempo de incubación y el tipo de célula (Figura 3 y Tabla 2).
3. Preparación de la solución
   NOTA: La preparación de la solución estándar tiene como objetivo simular las concentraciones iónicas dentro de la célula y los orgánulos. Por ejemplo, las soluciones estándar para medir los canales iónicos en los lisosomas son las siguientes:
   1. Prepare la solución de baño (en mM): 140 K-metanosulfonato (MSA), 5 KOH, 4 NaCl, 0,39 CaCl₂, 1 EGTA, 10 HEPES. Ajusta el pH a 7,2 con KOH. Ajustar la osmolaridad a 300 mosm/L con glucosa.
   2. Prepare la solución de pipeta (en mM): 140 Na-MSA, 5 K-MSA, 2 Ca-MSA, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 10 MES. Ajuste el pH a 4.6 con MSA. Ajustar la osmolaridad a 310 mosm/L con glucosa.
      NOTA: Pase la solución a través de un filtro de 0,2 μm, prepare alícuotas de 45 mL en tubos cónicos de 50 mL y guárdelos a 4 °C durante un máximo de 2-4 semanas.

3. Aislamiento de orgánulos

1. Extraiga un cubreobjetos con células tratadas (ver sección 2) de la placa de 24 pocillos, transfiéralo a la cámara del microscopio y agregue 1 ml de solución de baño.
   NOTA: Las células no deben almacenarse en la solución de baño durante >1 h para los experimentos de pinzamiento de parche endolisosomal completo que impliquen aislamiento, sellado y registro de endolisosomas. Después de 1 h, los endolisosomas agrandados se encogerán, se adherirán a la pipeta y serán difíciles de aislar.
2. Utilice una aguja de llenado de plástico casera para llenar la pipeta de aislamiento con solución de pipeta e instale la pipeta en el extremo delantero de la configuración de la abrazadera de parche.
3. Ajuste el ángulo de movimiento diagonal del micromanipulador para que esté cerca de 30° (valor predeterminado de fábrica).
4. Bajo el microscopio (objetivo de 40x y ocular de 10x), examine las células en busca de endosomas o lisosomas suficientemente agrandados ubicados cerca del borde de la membrana celular para su aislamiento. Acerque la pipeta de aislamiento a la célula seleccionada.
5. Bajar la pipeta de aislamiento con el micromanipulador hasta que toque el borde de la membrana plasmática (Figura 4). Mueva rápidamente la pipeta de aislamiento horizontalmente para arrancar un pequeño trozo de la membrana plasmática.
6. Con la misma pipeta, presione la célula desde el lado opuesto para exprimir el endosoma/lisosomas a una distancia de ~2 μm de la célula.
   NOTA: Si hay membrana celular residual en el orgánulo, puede prevenir la formación de un gigasello.
7. Examine el endolisosoma aislado bajo el microscopio.

4. Formación Gigaseal

1. Llene una pipeta de parche recién pulida con la solución de pipeta adecuada e instale la pipeta en el extremo frontal del amplificador.
2. Aplique de 20 a 50 mbar de presión positiva a la pipeta (o use 0,03-0,05 mL de una jeringa de 1 mL para controlar la presión) y mantenga esta presión (bloquee la válvula).
   NOTA: 1 mbar (milibar) = 0,001 bar = 0,1 kPa (kilopascale) = 1 hPa (hectopascale) = 1.000 dyn/cm2.
3. Al mover la punta de la pipeta dentro de la solución de baño, en el centro del campo de visión, confirme que la presión es lo suficientemente alta como para ver el líquido que fluye hacia la solución de baño.
4. Aplique pulsos de corriente repetidos (+5 mV; 5 ms) para determinar la resistencia de la pipeta, la resistencia del sello y la resistencia en serie. Controle el tamaño de la punta de la pipeta, la formación de sellos y el establecimiento de la configuración endolisosomal completa.
5. Mueva rápidamente la pipeta cerca de la parte superior de la vesícula objetivo. Acerque la pipeta a la vesícula hasta que la vesícula se mueva o ruede debido al flujo de líquido de la pipeta (figura 5).
6. Ajuste el voltaje de compensación de la pipeta a 0 mV. Libere inmediatamente la presión positiva. Idealmente, la vesícula será atraída hacia la pipeta y se conectará a la membrana, formando un gigaseal (1-20 GΩ) en 1 s. Busque una disminución a <10 pA de la amplitud de corriente evocada por el pulso de voltaje de 5 mV, lo que indica una formación exitosa de gigaseal.
   NOTA: La presión positiva estable es esencial para la formación de gigaseal. A veces, las fugas en la tubería pueden evitar la formación de gigaseal. Se recomienda utilizar un manómetro para asegurarse de que no haya fugas. Si se detecta una fuga, vuelva a colocar el tubo o aplique una pequeña cantidad de vaselina a las costuras para mejorar el sellado.

5. Medición de corriente

1. Rotura de membrana
   NOTA: Dependiendo de las necesidades experimentales, el contacto entre el electrodo y la membrana se puede clasificar en cuatro modos: modo conectado a la celda, modo de celda completa, modo de adentro hacia afuera y modo de afuera hacia afuera (Figura 6).
   1. Para el registro de vesículas completas, utilice un pulso corto de alto voltaje (pulso ZAP) de 200 μs o 500 μs para romper la membrana en el punto de contacto entre la pipeta y el orgánulo. Ajuste el voltaje de -500 mV a -1,200 mV, disminuyendo en 100 mV cada vez hasta que se rompa la membrana.
   2. Para el modo de adentro hacia afuera (grabación de un solo canal), después de formar el gigaseal, retire la pipeta del orgánulo, arrancando una pequeña pieza de la membrana, exponiendo el lado que originalmente estaba frente a la luz de la vesícula.
   3. Para el modo de afuera hacia afuera, después de formar el gigaseal y pasar al modo de vesícula completa, retire la pipeta del orgánulo, arrancando una pequeña pieza de la membrana mientras mantiene una pequeña estructura vesicular.
2. Grabación actual
   1. Registre la corriente a través de la membrana endolisosomal a medida que varía el voltaje de entrada en experimentos de pinza de parche de voltaje endolisosomal.
      1. Controle estos voltajes mediante pasos de voltaje o rampas de voltaje; utilizar una amplia gama de voltajes de entrada (por ejemplo, de -100 mV a +100 mV) en experimentos de pinza de voltaje endolisosomal.

Resultados

A continuación se describen las formas actuales observadas durante los experimentos endolisosomales de patch-clamp. Si la forma actual no es la esperada, podría deberse a un mal contacto o a una fuga. Puede producirse un contacto deficiente si el electrodo de referencia no está completamente en contacto con la solución de baño o si el electrodo de pipeta está a punto de romperse. Las fugas pueden ocurrir si hay un espacio entre la cámara y el cubreobjetos que permite que el fluido...

Discusión

Las configuraciones experimentales electrofisiológicas tienen cuatro requisitos principales de laboratorio: i) entorno: métodos para mantener la muestra sana; ii) óptica: métodos para visualizar la muestra; iii) mecánica: métodos para posicionar de manera estable el microelectrodo; y iv) electrónica: métodos para amplificar y registrar la señal.

Para realizar con éxito experimentos de pinzamiento endolisosomal, varios pasos clave son cruciales. Prime...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BOROSILICATE GLASS	SUTTER INSTRUMENT	BF150-75-10	O.D.:1.5 mm, I.D. 0.75 mm 10 cm length, with filament
Digidata 1140A	Axon Instruments
Inverted microscope IX73	OLYMPUS
MODEL P-97 micropipette puller	SUTTER INSTRUMENT
MPC-200	SUTTER INSTRUMENT
MultiClamp 700B	Axon Instruments
POLISHER
Quick Release Chamber	Warner instruments	641943	QR-40LP, for 25 mm Coverslips