단일 Endolysosomal 소포 분석을 위한 Patch-Clamp 기법

요약

이 프로토콜은 수동 endolysomal patch-clamp system을 사용하여 세포 내 소포의 이온 채널 활성을 직접 측정하는 방법을 자세히 설명합니다. 엔도리소좀(endolysosome)을 확대하고 이러한 소포를 수동으로 분리하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 통해 연구원은 절차를 정확하게 복제하고 적용할 수 있습니다.

초록

엔도리소좀 이온 채널은 엔도리소좀 이온 및 pH 항상성, 막 전위 조절 및 소포 이동에 매우 중요합니다. 그러나 작은 세포 내 소포체 내에서 이러한 채널에 전기생리학적으로 접근하는 것은 어려운 일이었습니다. 엔도리소좀 패치 클램프 기술의 개발은 이 장벽을 극복하는 데 중요한 역할을 했으며, 엔도리소좀 막에서 이온 채널 활성을 직접 측정할 수 있게 되었습니다.

기존의 평면 패치 클램프 기술과 비교하여 엔도리소좀 패치 클램프는 여러 세포를 동시에 기록하고 다른 측정 방법과 쉽게 결합할 수 있습니다. 수동 작동은 표적 소포를 시각화할 수 있는 이점을 제공합니다. 또한 엔도리소좀 막의 한쪽 면에 Ca²⁺ 가 반드시 존재하는 한계를 해결하여 실험 설계의 유연성을 높입니다. 엔도리소좀 patch-clamp 기술을 사용하면 엔도리소좀 내 이온 채널 활성을 직접 측정하고 분석할 수 있습니다.

비정상적인 엔도리소좀 이온 채널 기능과 신경퇴행성 질환 및 대사 장애와 같은 질병 사이의 밀접한 연관성을 감안할 때, 이러한 채널을 조사하고 조절하면 새로운 약물 표적을 밝힐 수 있습니다. 세포 내 이온 균형을 회복함으로써 관련 질병을 완화하거나 치료할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 새로운 약물 표적을 발견하고 관련 약물을 개발하는 데 중추적인 역할을 합니다.

서문

이온 채널은 수많은 생리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 표면 이온 채널은 상당한 주목을 받았지만, 세포 내 채널, 특히 엔도리소좀 내의 채널의 중요성은 점차 인정되고 있습니다. 엔도소좀 시스템은 재활용 엔도솜(RE), 초기 엔도솜(EE), 후기 엔도솜(LE), 리소좀(LY) 및 엔도소좀 및 식체(phagosome) 및 자가포식솜과 같은 기타 구획 특성을 모두 가진 하이브리드 소기관을 포함한 기본적인 세포 기능에 특화된 다기능 막 결합 소기관으로 구성됩니다.

분류 엔도솜(SE)이라고도 하는 EE는 원형질막(PM)에서 내재화된 물질의 초기 목적지 중 하나입니다. EE는 분해를 위해 LE/LY로 가는 성숙 경로, PM으로 돌아가는 빠른 재활용 경로, 재활용 구획 또는 주변 RE와 관련된 느린 재활용 경로와 같은 다양한 내세포 경로로 화물을 분류하는 중요한 구획입니다. 엔도솜에서 파생된 다소포체(Multivesicular body, MVB)는 제한 막(limiting membrane)으로 둘러싸인 구형 구획으로, ILV(intraluminal vesicles)로 채워질 수 있습니다¹. 이러한 소기관의 정상적인 기능을 유지하려면 소포 pH, 삼투압 및 신호 전달을 조절하는 멤브레인 이온 채널이 필요합니다. 그러나 이러한 채널의 활동을 측정하는 것은 간단하지 않습니다.

원형질막에 위치한 이온 채널의 경우, 1970년대에 개발된 패치 클램프 기법은 오랫동안 황금 표준 방법²이었습니다. 그러나 작은 세포 내 소포체 내에서 전기생리학적으로 채널에 접근하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 원형질막의 이온 채널을 측정하기 위한 황금 표준을 세포 내 소기관에 적용하는 것은 세 가지 주요 과제에 직면해 있습니다. 첫째, 엔돌리소좀의 크기는 일반적으로 매우 작아서(직경 1μm 미만) 현미경으로 관찰 및 분리하기 어렵고 일반적인 유리 마이크로피펫의 개구부 직경보다 작아 실험이 작동하지 않습니다. 둘째, 세포 소기관 무결성을 유지하면서 표적 세포에서 직접 엔도리소좀을 분리하려면 특별한 기술이 필요합니다. 셋째, 세포 내 소기관에 세포골격이 없기 때문에 패치 피펫 내의 내분해체 막에 밀봉을 형성한 다음 이를 파열하여 전체 내소체 구성을 달성하는 것은 소기관의 구조적 무결성을 손상시키기 때문에 어려울 수 있습니다³.

이러한 문제를 극복하기 위해 지질 이중층 기록, 리소좀 표적 염기서열 수정, 고체 지지 막 기반 전기생리학(SSM 또는 SSME) 기술을 포함한 여러 방법이 개발되었습니다. 지질 이중층 기록 방법은 정제된 이온 채널로 합성 인지질막을 재구성하는 것을 포함하며, 이를 통해 통제된 조건 하에서 막 단백질 기능에 대한 상세한 전기생리학적 연구를 수행할 수 있습니다 ^4,5. 이온 채널의 리소좀 표적화 염기서열 수정에는 기존의 patch-clamp 방법⁶을 사용하여 측정하기 위해 엔도리소좀 이온 채널을 원형질막으로 리디렉션하는 것이 포함됩니다. 엔도리소좀 평면 패치 클램프 방법이라고도 하는 고체 지지 멤브레인 기반 전기생리학(SSM 또는 SSME) 기술은 미세 구조 평면 붕규산염 칩에 작은 구멍(직경 <1μm)이 있는 고체 기판 평면 유리 칩을 사용합니다. 이 작은 조리개 유리 칩을 사용하면 압력 흡입 제어 시스템(Nanion)을 사용하여 작고 균일한 천연 분해체를 분석할 수 있습니다. 그러나 처음 두 가지 방법에서는 이온 채널이 자연적인 생리학적 환경에 있지 않습니다. 원형질막에서 발현되거나 지질 이중층으로 재구성된 리소좀 채널을 기록하려는 시도는 대체로 불확실하고 모순적인 결과를 낳았습니다.

평면 패치 클램프 기술은 인공 간섭 문제를 효과적으로 해결하고 고처리량 측정의 이점을 제공하지만, 사용되는 솔루션도 이 방법에 의해 제한됩니다. 이 기사에서 소개한 엔도리소좀 패치 클램프 기술은 여러 세포를 동시에 기록하고 다른 측정 방법과 쉽게 결합할 수 있습니다. 수동 작업은 대상 소포를 시각화할 수 있는 이점을 제공합니다. 또한 내염색체 막의 한쪽 면에 있는 용액에서 Ca²⁺의 피할 수 없는 한계를 극복하여 실험 설계³의 자유도를 높입니다. 최근에는 엔도리소좀 패치 클램프 기술이 약물 개발 연구에서 핵심적인 역할을 하고 있습니다. 예를 들어, 신경 퇴행성 질환에서 이 기술은 알츠하이머병 및 파킨슨병과 관련된 엔도리소좀 이온 채널을 표적으로 하는 신약을 식별하는 데 도움이 되었습니다 ^7,8. 연구자들은 또한 이 기술을 사용하여 종양 세포⁹에서 엔도리소좀 이온 채널의 역할을 탐구하여 종양의 성장과 증식을 제어할 수 있습니다. 대사 질환과 관련하여, 엔도리소좀 패치-클램프 연구는 엔도리소좀 이온 채널을 조절하는 화합물을 밝혀내고 있으며, 당뇨병과 비만에 대한 새로운 치료 접근법을 제공하고 있습니다. 엔도리소좀 패치-클램프 기법은 엔도리소좀 기능 장애를 이해하고 잠재적인 치료법을 찾는 데 도움이 되며⁶, 엔도리소좀 이온 채널 기능에 대한 이해를 크게 높이고 신약 표적의 발견을 촉진합니다.

프로토콜

1. 기기 설정

1. 하드웨어
   알림: 표준 전기생리학 장비 설정은 그림 1 을 참조하십시오.
   1. 테이블과 패러데이 케이지를 사용하여 외부 간섭으로부터 설정을 보호하십시오.
   2. 미세 전극을 안정적으로 배치하기 위해 미세 매니퓰레이터가 있는 도립 현미경을 사용하십시오.
   3. amp수집된 신호를 수집하고 증폭하기 위해 liifier를 설정합니다.
   4. 디지타이저를 사용하여 아날로그 신호를 디지털 신호로 변환합니다.
   5. 데이터 수집 및 분석 소프트웨어를 사용하여 실험 프로토콜을 설정하고 수집된 데이터에서 의미 있고 분석 가능한 결과를 추출합니다.
2. 전극
   1. 두 개의 전극을 사용하십시오 : 수조 전극과 피펫 전극.
      참고: 백금과 염화은은 최상의 편광 특성을 가지고 있습니다. 염화은 전극은 염화된 은 와이어 또는 펠릿으로 구성되므로 와이어 또는 펠릿의 외부 표면에 AgCl 층이 있습니다(그림 2).
3. 피펫 준비
   1. 당기
      1. 풀러에 모세관을 설치합니다.
         참고: 아래 피펫 제작에 사용되는 매개변수는 기기에 따라 다릅니다. 이 논문에서 사용한 기기는 Table of Materials에 언급되어 있습니다.
      2. 히터 필라멘트를 태우지 않는 실험 조건(실온 22°C, 관통형 히터 필라멘트, 필라멘트가 있는 붕규산 유리)에서 풀러에 대한 RAMP 테스트를 실행하여 유리 모세관을 녹이는 데 필요한 열값 (HEAT)을 측정합니다.
      3. HEAT, 속도(VEL) 및 시간(TIME) 매개변수를 사용하여 6개의 개별 풀 사이클로 새로운 풀링 프로그램을 설계합니다(표 1).
         알림: HEAT 는 히터의 필라멘트를 가열하여 유리 필라멘트가 녹을 수 있도록 하는 매개변수를 나타냅니다. 속도는 풀러가 필라멘트를 양방향으로 당기는 속도를 나타냅니다. 시간은 각 주기 사이의 간격의 지속 시간을 나타냅니다.
      4. 키패드의 녹색 당기기 버튼을 누릅니다.
      5. CL을 느슨하게amp손잡이를 잡고 풀러에서 피펫을 제거합니다.
      6. 마이크로포지의 접안렌즈 아래에 있는 피펫 팁을 검사하여 팁 직경, 선명도 및 형상을 확인합니다. 팁 직경이 0.5-0.9μm인지 확인합니다.
         참고: 필라멘트가 더 자주 사용됨에 따라 유리 모세관을 녹이는 데 필요한 열 값이 변합니다.
      7. 팁 크기가 기대에 미치지 못하면 HEAT 및 VEL 매개변수를 조정하십시오. 더 높은 온도와 더 빠른 속도는 더 미세하고 긴 팁을 생성하며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. HEAT를 5도 단위로 조정하고 속도를 3씩 조정합니다.
   2. 연마
      1. 당겨진 패치 피펫을 마이크로포지 홀더에 넣습니다.
      2. 35x 대물렌즈(15x 접안렌즈와 결합하여 525x 배율)를 사용하여 피펫 팁을 검사합니다.
      3. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 패치 피펫을 필라멘트에 가깝게 가져옵니다.
      4. 온도 다이얼을 80으로 설정합니다.
      5. 풋스위치를 사용하여 히터를 켜고 짧은 열 펄스 (1 - 2초)를 가하여 microforge 접안렌즈를 통해 연마 과정을 모니터링합니다.
      6. 모든 피펫이 연마될 때까지 이 과정을 반복합니다.
      7. 완성된 피펫을 밀봉된 상자에 넣어 먼지가 들어가지 않도록 합니다.
         참고: 목표는 팁을 빠르게 녹여서 유리가 너무 날카롭게 만들지 않고 최종 팁 형상을 변형하도록 하는 것입니다. 이는 피펫이 눌려진 소포막을 관통하는 것을 방지하고 밀봉 형성을 효과적으로 촉진합니다. 최종 연마 후 피펫 팁의 내부 경로는 매우 좁고 직선이며 선형이어야 합니다.
         가장 잘 기록되는 피펫은 일반적으로 화재 연마 후 5 - 8 MΩ의 저항을 갖습니다. 팁 개구부 직경은 2μm여야 합니다. 완벽하게 연마된 패치 피펫은 성공적인 기가씰 형성에 필수적이며, 이는 절차의 성공에 중요한 핵심 기술 중 하나이기 때문입니다.

2. 시료 준비

1. 세포 배양(HEK293을 예로 사용)
   1. 표준 가습 인큐베이터에서 37°C에서 5% CO₂로 세포를 배양합니다.
   2. 10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신이 보충된 저혈당 DMEM에서 HEK293 세포를 배양합니다.
   3. 폴리-L-라이신 코팅된 12mm 커버슬립을 24웰 플레이트에 놓습니다.
2. 소기관 확대
   1. 24웰 플레이트의 HEK293 세포에 1μM vacuolin-1을 추가하고(단계 2.1에서) 비대해진 소포가 형성되기 시작할 때까지 37°C에서 5% CO₂ 로 하룻밤 동안 배양합니다.
      참고: 확대된 엔도리소좀의 크기는 도구, 화합물, 배양 시간 및 세포 유형에 따라 1-10μm에 달할 수 있습니다(그림 3 및 표 2).
3. 용액 준비
   참고: 표준 용액 준비는 세포와 세포 기관 내부의 이온 농도를 시뮬레이션하는 것을 목표로 합니다. 예를 들어, 리소좀에서 이온 채널을 측정하기 위한 표준 솔루션은 다음과 같습니다.
   1. 수조 용액 준비 (mM) : 140 K- 메탄 설포 네이트 (MSA), 5 KOH, 4 NaCl, 0.39 CaCl₂, 1 EGTA, 10 HEPES. KOH로 pH를 7.2로 조정합니다. 포도당으로 삼투압을 300mosm/L로 조정합니다.
   2. 피펫 용액 준비 (mM) : 140 Na-MSA, 5 K-MSA, 2 Ca-MSA, 1 CaCl₂, 10 Hepes, 10 MES. MSA를 사용하여 pH를 4.6으로 조정합니다. 포도당으로 삼투압을 310 mosm/L로 조정합니다.
      참고: 용액을 0.2μm 필터에 통과시키고 50mL 코니컬 튜브에 45mL 부분 표본을 준비한 다음 4°C에서 최대 2-4주 동안 보관합니다.

3. 세포 기관 격리

1. 24웰 플레이트에서 처리된 세포가 있는 커버슬립(섹션 2 참조)을 제거하고 현미경 챔버로 옮긴 다음 1mL의 수조 용액을 추가합니다.
   참고: 세포는 내분해체 분리, 밀봉 및 기록을 포함하는 전체 내분해체 패치 클램프 실험의 경우 >1시간 동안 수조 용액에 보관해서는 안 됩니다. 1시간이 지나면 확대된 엔도리소좀이 줄어들고 피펫에 달라붙어 분리하기 어려워집니다.
2. 집에서 만든 플라스틱 충전 바늘을 사용하여 절연 피펫에 피펫 용액을 채우고 패치 cl의 전면 끝에 피펫을 설치합니다.amp 설정.
3. micromanipulator의 대각선 이동 각도를 30°(공장 기본값)에 가깝게 설정합니다.
4. 현미경(대물렌즈 40개 및 접안렌즈 10개)으로 세포를 검사하여 세포막 가장자리 근처에 위치한 충분히 확대된 엔도솜 또는 리소좀이 있는지 격리를 위해 세포를 검사합니다. 분리 피펫을 선택한 셀 가까이로 이동합니다.
5. micromanipulator를 사용하여 원형질막의 가장자리에 닿을 때까지 분리 피펫을 내립니다(그림 4). 격리 피펫을 수평으로 빠르게 움직여 원형질막의 작은 조각을 떼어냅니다.
6. 동일한 피펫을 사용하여 반대쪽에서 세포를 눌러 엔도솜/리소좀을 세포에서 ~2μm 거리까지 짜냅니다.
   참고: 세포 소기관에 잔류 세포막이 있으면 기가씰의 형성을 방해할 수 있습니다.
7. 현미경으로 분리된 내분해체를 검사합니다.

4. 기가씰 형성

1. 갓 광택을 낸 패치 피펫에 적절한 피펫 용액을 채우고 앰프의 앞쪽 끝에 피펫을 설치합니다.
2. 피펫에 20 - 50mbar 의 양압을 가하고(또는 압력 제어를 위해 1mL 주사기에서 0.03-0.05mL 사용) 이 압력을 유지합니다(밸브 잠금).
   참고: 1mbar(밀리바) = 0.001bar = 0.1kPa(킬로파스칼) = 1hPa(헥토파스칼) = 1,000dyn/cm2.
3. 피펫 팁을 수조 용액으로 옮기고 시야 중앙에 있는 경우 압력이 수조 용액으로 흐르는 액체를 볼 수 있을 만큼 충분히 높은지 확인합니다.
4. 반복 전류 펄스 (+5 mV, 5 ms) 를 적용하여 피펫 저항, 밀봉 저항 및 직렬 저항을 측정합니다. 피펫 팁 크기, 밀봉 형성 및 전체 엔도리소좀 구성 설정을 모니터링합니다.
5. 피펫을 대상 소포의 상단 가까이로 빠르게 이동합니다. 피펫의 유체 흐름으로 인해 소포가 움직이거나 굴러갈 때까지 피펫을 소포 근처로 가져옵니다(그림 5).
6. 피펫의 오프셋 전압을 0mV로 조정합니다. 즉시 양압을 해제하십시오. 이상적으로는 소포가 피펫 쪽으로 당겨져 멤브레인에 연결되어 1초 이내에 기가씰(1-20GΩ)을 형성합니다.5mV의 전압 펄스에 의해 유발되는 전류 진폭의 <10pA로 감소하는 것을 확인하며, 이는 성공적인 기가씰 형성을 나타냅니다.
   참고: 안정적인 양압은 기가씰 형성에 필수적입니다. 때때로 튜브의 누출로 인해 기가씰이 형성되지 않을 수 있습니다. 누출이 없는지 확인하기 위해 압력 게이지를 사용하는 것이 좋습니다. 누출이 감지되면 튜브를 다시 부착하거나 이음새에 소량의 바셀린을 바르면 밀봉이 개선됩니다.

5. 전류 측정

1. 멤브레인 파손
   참고: 실험 요구 사항에 따라 전극-멤브레인 접촉은 세포 부착 모드, 전체 세포 모드, 인사이드-아웃 모드 및 아웃사이드-아웃 모드의 네 가지 모드로 분류할 수 있습니다(그림 6).
   1. 전체 소포 기록의 경우 200μs 또는 500μs 의 고전압 단락 펄스(ZAP 펄스)를 사용하여 피펫과 소기관 사이의 접촉점에서 멤브레인을 절단합니다. 전압을 -500mV 에서 -1,200mV로 설정하고 멤브레인이 중단될 때까지 매번 100mV 씩 감소합니다.
   2. 인사이드 아웃(단일 채널 기록) 모드의 경우, 기가씰을 형성한 후 피펫을 소기관에서 당겨 멤브레인의 작은 조각을 떼어내고 원래 소포 내강을 향하고 있던 면을 노출시킵니다.
   3. 아웃사이드-아웃 모드의 경우, 기가씰을 형성하고 전체 소포 모드로 전환한 후 피펫을 소기관에서 당겨 작은 소포 구조를 유지하면서 멤브레인의 작은 조각을 떼어냅니다.
2. 현재 녹음 중
   1. endolysosomal voltage-clamp patch-clamp 실험에서 입력 전압이 변할 때 endolysosomal membrane을 통과하는 전류를 기록합니다.
      1. 전압 단계 또는 전압 램프로 이러한 전압을 제어합니다. 엔도리소좀 전압 클램프 실험에서 광범위한 입력 전압( 예: -100 mV 에서 +100 mV)을 사용합니다.

결과

다음은 endolysosomal patch-clamp 실험에서 관찰된 현재 모양에 대해 설명합니다. 현재 모양이 예상과 다르면 접촉 불량 또는 누출 때문일 수 있습니다. 기준 전극이 수조 용액과 완전히 접촉하지 않거나 피펫 전극이 파손되려고 하는 경우 접촉 불량이 발생할 수 있습니다. 챔버와 커버슬립 사이에 틈이 있어 유체가 대물 렌즈 또는 스테이지로 흐를 수 있는 경우 누출이 발생할 ?...

토론

전기 생리학 실험 설정에는 네 가지 주요 실험실 요구 사항이 있습니다 : i) 환경 : 샘플을 건강하게 유지하는 방법; ii) 광학: 샘플을 시각화하는 방법; iii) 역학: 미세 전극을 안정적으로 배치하는 방법; 및 iv) 전자 장치: 신호를 증폭하고 기록하는 방법.

엔도리소좀 패치 클램프 실험을 성공적으로 수행하려면 몇 가지 주요 단계가 중요합니다. 첫째, 세...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BOROSILICATE GLASS	SUTTER INSTRUMENT	BF150-75-10	O.D.:1.5 mm, I.D. 0.75 mm 10 cm length, with filament
Digidata 1140A	Axon Instruments
Inverted microscope IX73	OLYMPUS
MODEL P-97 micropipette puller	SUTTER INSTRUMENT
MPC-200	SUTTER INSTRUMENT
MultiClamp 700B	Axon Instruments
POLISHER
Quick Release Chamber	Warner instruments	641943	QR-40LP, for 25 mm Coverslips