Tecniche di patch-clamp per l'analisi di singole vescicole endolisosomiali

Riepilogo

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per misurare direttamente l'attività dei canali ionici sulle vescicole intracellulari utilizzando un sistema manuale di patch-clamp endolisosomiale. Illustriamo il metodo che prevede l'ingrandimento degli endolisosomi e l'isolamento manuale di queste vescicole. Questo approccio garantisce che i ricercatori possano replicare e applicare accuratamente la procedura.

Abstract

I canali ionici endolisosomiali sono fondamentali per l'omeostasi degli ioni endolisosomiale e del pH, la regolazione del potenziale di membrana e il traffico delle vescicole. Tuttavia, l'accesso elettrofisiologico a questi canali all'interno di piccole vescicole intracellulari è stata una sfida. Lo sviluppo di tecniche di patch-clamp endolisosomiale è stato determinante per superare questa barriera, consentendo la misurazione diretta dell'attività dei canali ionici nelle membrane endolisosomiali.

Rispetto alle attuali tecniche di patch-clamp planare, il patch-clamp endolisosomiale può registrare contemporaneamente più cellule e combinarsi facilmente con altri metodi di misurazione. Il funzionamento manuale offre il vantaggio di visualizzare vescicole mirate. Affronta anche la limitazione dell'indispensabile presenza di Ca²⁺ su un lato della membrana endolisosomiale, aumentando la flessibilità del disegno sperimentale. L'utilizzo di tecniche di patch-clamp endolisosomiale consente la misurazione e l'analisi diretta dell'attività dei canali ionici all'interno degli endolisosomi.

Dato lo stretto legame tra la funzione aberrante dei canali ionici endolisosomiali e malattie come le malattie neurodegenerative e i disturbi metabolici, lo studio e la modulazione di questi canali potrebbero svelare nuovi bersagli farmacologici. Ripristinando l'equilibrio ionico intracellulare, possiamo alleviare o curare le malattie correlate. Pertanto, questa tecnica è fondamentale per scoprire nuovi bersagli farmacologici e sviluppare farmaci pertinenti.

Introduzione

I canali ionici svolgono un ruolo cruciale in numerosi processi fisiologici. Mentre i canali ionici di superficie hanno ricevuto un'attenzione significativa, l'importanza dei canali intracellulari, in particolare quelli all'interno degli endolisosomi, viene gradualmente riconosciuta. Il sistema endolisosomiale è composto da organelli multifunzionali legati alla membrana specializzati per funzioni cellulari fondamentali, tra cui endosomi di riciclo (RE), endosomi precoci (EE), endosomi tardivi (LE), lisosomi (LY) e organelli ibridi con caratteristiche sia endolisosomiali che di altro tipo, come fagosomi e autofagosomi.

Gli EE, noti anche come endosomi di smistamento (SE), sono una delle prime destinazioni per i materiali internalizzati dalla membrana plasmatica (PM). Gli EE sono compartimenti critici responsabili dello smistamento del carico in varie vie endocitiche, come la via di maturazione verso LE/LY per la degradazione, la via di riciclaggio rapido verso il PM e la via di riciclaggio lenta che coinvolge il compartimento di riciclaggio o RE periferico. I corpi multivescicolari (MVB) derivati dagli endosomi sono compartimenti sferici circondati da una membrana limitante, che può essere riempita con vescicole intraluminali (ILV⁾¹. Per mantenere la normale funzione di questi organelli, richiedono canali ionici di membrana per regolare il pH vescicolare, l'osmolarità e la trasduzione del segnale. Tuttavia, misurare l'attività di questi canali non è semplice.

Per i canali ionici situati sulla membrana plasmatica, la tecnica patch-clamp sviluppata negli anni '70 è stata a lungo il metodo gold standard². Tuttavia, l'accesso elettrofisiologico ai canali all'interno di piccole vescicole intracellulari è rimasto una sfida. L'applicazione del gold standard per la misurazione dei canali ionici sulla membrana plasmatica a quelli sugli organelli intracellulari deve affrontare tre sfide principali. In primo luogo, la dimensione degli endolisosomi è in genere molto piccola (meno di 1 μm di diametro), il che li rende difficili da osservare e isolare al microscopio e più piccola del diametro di apertura delle tipiche micropipette di vetro, rendendo l'esperimento inutilizzabile. In secondo luogo, isolare gli endolisosomi direttamente dalle cellule bersaglio mantenendo l'integrità degli organelli richiede abilità speciali. In terzo luogo, a causa dell'assenza di un citoscheletro negli organelli intracellulari, formare un sigillo sulla membrana endolisosomiale all'interno della pipetta patch e quindi romperla per ottenere una configurazione dell'intero endolisosoma può essere difficile, in quanto compromette l'integrità strutturale dell'organello³.

Sono stati sviluppati diversi metodi per superare questi problemi, tra cui la registrazione del doppio strato lipidico, la modifica delle sequenze di targeting lisosomiale e le tecniche di elettrofisiologia basata su membrana solida (SSM o SSME). Il metodo di registrazione del doppio strato lipidico prevede la ricostruzione di membrane fosfolipidiche sintetiche con canali ionici purificati, consentendo uno studio elettrofisiologico dettagliato della funzione delle proteine di membrana in condizioni controllate ^4,5. La modifica delle sequenze di targeting lisosomiale sui canali ionici comporta il reindirizzamento dei canali ionici endolisosomiali alla membrana plasmatica per la misurazione utilizzando i metodi convenzionali di patch-clamp⁶. Le tecniche di elettrofisiologia basata su membrana solida (SSM o SSME), note anche come metodo di patch-clamp planare endolisosomiale, utilizzano chip di vetro planare su substrato solido con piccole aperture (<1 μm di diametro) in chip borosilicati planari microstrutturati. Questi chip di vetro a piccola apertura consentono l'analisi di endolisosomi di piccole dimensioni, anche nativi, utilizzando un sistema di controllo dell'aspirazione a pressione (Nanion). Tuttavia, nei primi due metodi, i canali ionici non si trovano nel loro ambiente fisiologico naturale. I tentativi di registrare i canali lisosomiali espressi sulla membrana plasmatica o ricostituiti in doppi strati lipidici hanno prodotto risultati in gran parte incerti e contraddittori.

Sebbene le tecniche di patch-clamp planare abbiano affrontato efficacemente il problema dell'interferenza artificiale e offrano il vantaggio di misure ad alto rendimento, anche le soluzioni utilizzate sono limitate da questo metodo. La tecnica del patch-clamp endolisosomiale introdotta in questo articolo può registrare contemporaneamente più cellule e combinarla facilmente con altri metodi di misurazione. Il funzionamento manuale offre il vantaggio di visualizzare le vescicole target. Supera anche l'inevitabile limitazione del Ca²⁺ nella soluzione su un lato della membrana endolisosomiale, aumentando la libertà del disegno sperimentale³. Recentemente, le tecniche di patch-clamp endolisosomiale hanno svolto un ruolo chiave nella ricerca sullo sviluppo di farmaci. Ad esempio, nelle malattie neurodegenerative, questa tecnica ha contribuito a identificare nuovi farmaci mirati ai canali ionici endolisosomiali associati alle malattie di Alzheimer e Parkinson ^7,8. I ricercatori possono anche utilizzare questa tecnica per esplorare il ruolo dei canali ionici endolisosomiali nelle cellule tumorali⁹, controllando così la crescita e la proliferazione del tumore. Per quanto riguarda le malattie metaboliche, gli studi sul patch-clamp endolisosomiale stanno rivelando composti che regolano i canali ionici endolisosomiali, offrendo nuovi approcci terapeutici per il diabete e l'obesità. La tecnica del patch-clamp endolisosomiale aiuta a comprendere la disfunzione endolisosomiale e a trovare potenziali terapie⁶, migliorando significativamente la nostra comprensione delle funzioni dei canali ionici endolisosomiali e promuovendo la scoperta di nuovi bersagli farmacologici.

Protocollo

1. Configurazione dello strumento

1. Hardware
   NOTA: Vedere la Figura 1 per una configurazione standard del rig di elettrofisiologia.
   1. Proteggi l'impianto dalle interferenze esterne utilizzando un tavolo e una gabbia di Faraday.
   2. Utilizzare un microscopio invertito con un micromanipolatore per posizionare stabilmente il microelettrodo.
   3. Imposta un amplificatore per raccogliere e amplificare i segnali acquisiti.
   4. Utilizzare un digitalizzatore per convertire i segnali analogici in segnali digitali.
   5. Utilizza il software di acquisizione e analisi dei dati per impostare protocolli sperimentali ed estrarre risultati significativi e analizzabili dai dati raccolti.
2. Elettrodi
   1. Utilizzare due elettrodi: un elettrodo da bagno e un elettrodo per pipetta.
      NOTA: Il platino e il cloruro d'argento hanno le migliori proprietà di polarizzazione. Gli elettrodi di cloruro d'argento sono costituiti da filo o pellet d'argento che sono stati clorurati, quindi hanno uno strato di AgCl sulla superficie esterna del filo o del pellet (Figura 2).
3. Preparazione della pipetta
   1. Tirata
      1. Installare il tubo capillare nell'estrattore.
         NOTA: I parametri utilizzati per la fabbricazione delle pipette riportati di seguito sono specifici dello strumento. Lo strumento che abbiamo usato in questo articolo è menzionato nella Tabella dei Materiali.
      2. In condizioni sperimentali (temperatura ambiente 22 °C, filamento riscaldante di forma passante, vetro borosilicato con filamento) che non bruciano il filamento riscaldante, eseguire un test RAMP sull'estrattore per determinare il potere calorifico (HEAT) necessario per fondere il capillare di vetro.
      3. Progetta un nuovo programma di trazione con sei cicli di trazione separati utilizzando i parametri CALORE, velocità (VEL) e tempo (TIME) (Tabella 1).
         NOTA: HEAT si riferisce al parametro che riscalda il filamento del riscaldatore, consentendo al filamento di vetro di sciogliersi. La velocità indica la velocità con cui l'estrattore tira il filamento in entrambe le direzioni. Il tempo rappresenta la durata dell'intervallo tra ogni ciclo.
      4. Premere il pulsante verde Pull sulla tastiera.
      5. Allentare la manopola di serraggio e rimuovere le pipette dall'estrattore.
      6. Ispezionare i puntali della pipetta sotto l'oculare della microforgia per determinare il diametro, l'affilatura e la geometria del puntale. Assicurarsi che il diametro della punta sia 0,5-0,9 μm.
         NOTA: Poiché il filamento viene utilizzato più frequentemente, il valore di calore richiesto per fondere il capillare di vetro cambierà.
      7. Se la dimensione della punta non soddisfa le aspettative, regolare i parametri HEAT e VEL. Temperature più elevate e velocità più elevate produrranno punte più fini e più lunghe e viceversa. Regolare il CALORE con incrementi di 5 gradi e la velocità con incrementi di 3.
   2. Lucidatura
      1. Posizionare le pipette per cerotti estratte nel supporto per microforgia.
      2. Ispezionare i puntali delle pipette utilizzando una lente dell'obiettivo 35x (combinata con un oculare 15x, con conseguente ingrandimento 525x ).
      3. Utilizzare il micromanipolatore per avvicinare le pipette dei cerotti al filamento.
      4. Impostare la manopola della temperatura su 80.
      5. Utilizzare l'interruttore a pedale per accendere il riscaldatore e applicare un breve impulso di calore (1 - 2 s), monitorando il processo di lucidatura attraverso l'oculare della microforgia.
      6. Ripetere il processo fino a quando tutte le pipette non sono lucidate.
      7. Riporre le pipette completate in una scatola sigillata per evitare l'ingresso di polvere.
         NOTA: L'obiettivo è quello di fondere rapidamente la punta in modo che il vetro riformi la geometria finale della punta senza renderla troppo affilata. Ciò impedisce alla pipetta di penetrare nella membrana della vescicola contro cui viene premuta e favorisce efficacemente la formazione della tenuta. Dopo la lucidatura finale, il percorso interno della punta della pipetta deve essere molto stretto, dritto e lineare.
         Le migliori pipette di registrazione hanno in genere una resistenza di 5 - 8 MΩ dopo la lucidatura a fuoco. Il diametro dell'apertura della punta deve essere di 2 μm. Una pipetta patch perfettamente lucidata è essenziale per la corretta formazione di gigaseal, poiché questa è una delle tecniche chiave cruciali per il successo della procedura.

2. Preparazione del campione

1. Coltura cellulare (utilizzando HEK293 come esempio)
   1. Coltura delle cellule in un incubatore umidificato standard a 37 °C con CO₂ al 5%.
   2. Coltura delle cellule HEK293 in DMEM a basso contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS), 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina.
   3. Posizionare i vetrini coprioggetti da 12 mm rivestiti in poli-L-lisina in una piastra a 24 pozzetti.
2. Ingrandimento organelli
   1. Aggiungere 1 μM di vacuolina-1 alle cellule HEK293 nella piastra a 24 pozzetti (dal passaggio 2.1) e incubare a 37 °C con CO₂ al 5% per una notte fino a quando iniziano a formarsi vescicole ingrossate.
      NOTA: La dimensione degli endolisosomi ingranditi può raggiungere 1-10 μm, a seconda dello strumento, del composto, del tempo di incubazione e del tipo di cellula (Figura 3 e Tabella 2).
3. Preparazione della soluzione
   NOTA: La preparazione della soluzione standard mira a simulare le concentrazioni ioniche all'interno della cellula e degli organelli. Ad esempio, le soluzioni standard per la misurazione dei canali ionici sui lisosomi sono le seguenti:
   1. Preparare la soluzione del bagno (in mM): 140 K-metanosulfonato (MSA), 5 KOH, 4 NaCl, 0,39 CaCl₂, 1 EGTA, 10 HEPES. Regolare il pH a 7,2 con KOH. Regolare l'osmolarità a 300 mosm/L con glucosio.
   2. Preparare la soluzione della pipetta (in mM): 140 Na-MSA, 5 K-MSA, 2 Ca-MSA, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 10 MES. Regolare il pH a 4,6 con MSA. Regolare l'osmolarità a 310 mosm/L con glucosio.
      NOTA: Passare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm, preparare aliquote da 45 mL in provette coniche da 50 mL e conservarle a 4 °C per un massimo di 2-4 settimane.

3. Isolamento degli organelli

1. Rimuovere un vetrino coprioggetti con le cellule trattate (vedere paragrafo 2) dalla piastra a 24 pozzetti, trasferirlo nella camera del microscopio e aggiungere 1 mL di soluzione per il bagno.
   NOTA: Le cellule non devono essere conservate nella soluzione del bagno per >1 ora per gli esperimenti di patch-clamp dell'intero endolisosomiale che comportano l'isolamento, la sigillatura e la registrazione dell'endolisosoma. Dopo 1 ora, gli endolisosomi ingrossati si restringono, aderiscono alla pipetta e diventano difficili da isolare.
2. Utilizzare un ago di riempimento in plastica fatto in casa per riempire la pipetta isolante con la soluzione per pipette e installare la pipetta all'estremità anteriore della configurazione del patch-clamp.
3. Impostare l'angolo di movimento diagonale del micromanipolatore in modo che sia vicino a 30° (valore predefinito di fabbrica).
4. Al microscopio (obiettivo 40x e oculare 10x), esaminare le cellule per verificare la presenza di endosomi o lisosomi sufficientemente ingranditi situati vicino al bordo della membrana cellulare per l'isolamento. Avvicinare la pipetta di isolamento alla cella selezionata.
5. Abbassare la pipetta di isolamento utilizzando il micromanipolatore fino a toccare il bordo della membrana plasmatica (Figura 4). Spostare rapidamente la pipetta di isolamento orizzontalmente per strappare un piccolo pezzo della membrana plasmatica.
6. Utilizzando la stessa pipetta, premere la cellula dal lato opposto per spremere l'endosoma/i lisosomi a una distanza di ~2 μm dalla cellula.
   NOTA: Se c'è una membrana cellulare residua sull'organello, può impedire la formazione di un gigaseal.
7. Esaminare l'endolisosoma isolato al microscopio.

4. Formazione di gigaseal

1. Riempire una pipetta patch appena lucidata con la soluzione appropriata e installare la pipetta all'estremità anteriore dell'amplificatore.
2. Applicare 20-50 mbar di pressione positiva alla pipetta (o utilizzare 0,03-0,05 mL da una siringa da 1 mL per il controllo della pressione) e mantenere questa pressione (bloccare la valvola).
   NOTA: 1 mbar (millibar) = 0,001 bar = 0,1 kPa (kilopascal) = 1 hPa (ettopascal) = 1.000 dyn/cm2.
3. Spostando la punta della pipetta nella soluzione del bagno, al centro del campo visivo, verificare che la pressione sia sufficientemente alta da vedere il liquido fluire nella soluzione del bagno.
4. Applicare impulsi di corrente ripetuti (+5 mV; 5 ms) per determinare la resistenza della pipetta, la resistenza della tenuta e la resistenza in serie. Monitorare le dimensioni del puntale della pipetta, la formazione della guarnizione e l'instaurazione della configurazione endolisosomiale dell'intero metro.
5. Spostare rapidamente la pipetta vicino alla parte superiore della vescicola target. Avvicinare la pipetta alla vescicola finché la vescicola non si muove o rotola a causa del flusso di fluido dalla pipetta (Figura 5).
6. Regolare la tensione di offset della pipetta su 0 mV. Rilasciare immediatamente la pressione positiva. Idealmente, la vescicola sarà attirata verso la pipetta e collegata alla membrana, formando un gigaseal (1-20 GΩ) entro 1 s<.
   NOTA: Una pressione positiva stabile è essenziale per la formazione di gigaseal. A volte, le perdite nei tubi possono prevenire la formazione di gigaseal. Si consiglia di utilizzare un manometro per assicurarsi che non vi siano perdite. Se viene rilevata una perdita, ricollegare il tubo o applicare una piccola quantità di vaselina sulle cuciture per migliorare la tenuta.

5. Misurazione della corrente

1. Rottura della membrana
   NOTA: A seconda delle esigenze sperimentali, il contatto elettrodo-membrana può essere classificato in quattro modalità: modalità collegata alla cella, modalità a cella intera, modalità inside-out e modalità outside-out (Figura 6).
   1. Per la registrazione dell'intera vescicola, utilizzare un impulso corto ad alta tensione (impulso ZAP) di 200 μs o 500 μs per rompere la membrana nel punto di contatto tra la pipetta e l'organello. Impostare la tensione da -500 mV a -1.200 mV, diminuendo di 100 mV ogni volta fino a quando la membrana non viene interrotta.
   2. Per la modalità inside-out (registrazione a canale singolo), dopo aver formato il gigaseal, estrarre la pipetta dall'organello, strappando un piccolo pezzo di membrana, esponendo il lato che originariamente era rivolto verso il lume della vescicola.
   3. Per la modalità outside-out, dopo aver formato il gigaseal e essere passati alla modalità vescicola intera, estrarre la pipetta dall'organello, strappando un piccolo pezzo di membrana pur mantenendo una piccola struttura vescicolare.
2. Registrazione corrente
   1. Registrare la corrente attraverso la membrana endolisosomiale al variare della tensione di ingresso negli esperimenti di patch-clamp di tensione endolisosomiale.
      1. Controllare queste tensioni tramite gradini di tensione o rampe di tensione; utilizzare un'ampia gamma di tensioni di ingresso (ad esempio, da -100 mV a +100 mV) in esperimenti di voltage-clamp endolisosomiale.

Risultati

Di seguito vengono descritte le forme attuali osservate durante gli esperimenti di patch-clamp endolisosomiale. Se la forma attuale non è quella prevista, potrebbe essere dovuto a uno scarso contatto o a una perdita. Se l'elettrodo di riferimento non è completamente a contatto con la soluzione del bagno o se l'elettrodo della pipetta sta per rompersi, può verificarsi uno scarso contatto. Le perdite possono verificarsi se c'è uno spazio tra la camera e il vetrino coprioggetti che cons...

Discussione

Le configurazioni sperimentali elettrofisiologiche hanno quattro requisiti principali di laboratorio: i) ambiente: metodi per mantenere il campione sano; ii) ottica: metodi per visualizzare il campione; iii) meccanica: metodi per posizionare stabilmente il microelettrodo; e iv) elettronica: metodi per amplificare e registrare il segnale.

Per eseguire con successo gli esperimenti di patch-clamp endolisosomiale, sono cruciali diversi passaggi chiave. In primo lu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BOROSILICATE GLASS	SUTTER INSTRUMENT	BF150-75-10	O.D.:1.5 mm, I.D. 0.75 mm 10 cm length, with filament
Digidata 1140A	Axon Instruments
Inverted microscope IX73	OLYMPUS
MODEL P-97 micropipette puller	SUTTER INSTRUMENT
MPC-200	SUTTER INSTRUMENT
MultiClamp 700B	Axon Instruments
POLISHER
Quick Release Chamber	Warner instruments	641943	QR-40LP, for 25 mm Coverslips