Tek Endolisozomal Vezikül Analizi için Yama-Klemp Teknikleri

Özet

Bu protokol, manuel bir endolizozomal yama-kelepçe sistemi kullanarak hücre içi veziküller üzerindeki iyon kanalı aktivitesini doğrudan ölçmek için bir yöntemi detaylandırır. Endolizozomların büyütülmesini ve bu veziküllerin manuel olarak izole edilmesini içeren yöntemi gösteriyoruz. Bu yaklaşım, araştırmacıların prosedürü doğru bir şekilde tekrarlayabilmelerini ve uygulayabilmelerini sağlar.

Özet

Endolizozomal iyon kanalları, endolizozomal iyon ve pH homeostazı, membran potansiyel regülasyonu ve vezikül kaçakçılığı için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, elektrofizyolojik olarak bu kanallara küçük hücre içi veziküller içinde erişmek zor olmuştur. Endolizozomal yama-klemp tekniklerinin geliştirilmesi, endolizozomal membranlarda iyon kanalı aktivitesinin doğrudan ölçülmesine izin vererek bu engelin üstesinden gelmede etkili olmuştur.

Mevcut düzlemsel yama kelepçesi teknikleriyle karşılaştırıldığında, endolizozomal yama kelepçesi aynı anda birden fazla hücreyi kaydedebilir ve diğer ölçüm yöntemleriyle kolayca birleştirilebilir. Manuel çalıştırma, hedeflenen vezikülleri görselleştirme avantajı sunar. Ayrıca, endolizozomal membranın bir tarafında Ca^{2 +} 'nın vazgeçilmez varlığının sınırlamasını da ele alarak deneysel tasarımın esnekliğini arttırır. Endolizozomal yama-klemp tekniklerinin kullanılması, endolizozomlar içindeki iyon kanalı aktivitesinin doğrudan ölçülmesini ve analiz edilmesini sağlar.

Anormal endolizozomal iyon kanalı fonksiyonu ile nörodejeneratif hastalıklar ve metabolik bozukluklar gibi hastalıklar arasındaki yakın ilişki göz önüne alındığında, bu kanalların araştırılması ve modüle edilmesi yeni ilaç hedeflerini ortaya çıkarabilir. Hücre içi iyon dengesini yeniden sağlayarak, ilgili hastalıkları hafifletebilir veya iyileştirebiliriz. Bu nedenle, bu teknik yeni ilaç hedeflerini keşfetmek ve ilgili ilaçları geliştirmek için çok önemlidir.

Giriş

İyon kanalları çok sayıda fizyolojik süreçte çok önemli bir rol oynar. Yüzey iyon kanalları önemli ölçüde dikkat çekerken, hücre içi kanalların, özellikle de endolizozomların içindeki kanalların önemi yavaş yavaş kabul edilmektedir. Endolizozomal sistem, geri dönüşüm endozomları (RE), erken endozomlar (EE), geç endozomlar (LE), lizozomlar (LY) ve hem endolizozomal hem de fagozomlar ve otofagozomlar gibi diğer bölme özelliklerine sahip hibrit organeller dahil olmak üzere temel hücresel işlevler için özelleşmiş çok işlevli, zara bağlı organellerden oluşur.

Sıralama endozomları (SE) olarak da bilinen EE, plazma zarından (PM) içselleştirilen materyaller için daha önceki hedeflerden biridir. EE'ler, kargoyu bozunma için LE/LY'ye giden olgunlaşma yolu, PM'ye geri dönen hızlı geri dönüşüm yolu ve geri dönüşüm bölmesini veya periferik RE'yi içeren yavaş geri dönüşüm yolu gibi çeşitli endositik yollara ayırmaktan sorumlu kritik bölmelerdir. Endozomlardan türetilen multiveziküler cisimler (MVB'ler), intraluminal veziküller (ILV'ler) ile doldurulabilen sınırlayıcı bir zarla çevrili küresel ^{bölmelerdir1}. Bu organellerin normal işlevini sürdürmek için, veziküler pH, ozmolarite ve sinyal iletimini düzenlemek için zar iyon kanallarına ihtiyaç duyarlar. Ancak, bu kanalların aktivitesini ölçmek kolay değildir.

Plazma zarı üzerinde bulunan iyon kanalları için, 1970'lerde geliştirilen yama-kelepçe tekniği uzun zamandır altın standart yöntem² olmuştur. Bununla birlikte, küçük hücre içi veziküller içinde elektrofizyolojik olarak kanallara erişmek bir zorluk olmaya devam etmiştir. Plazma zarındaki iyon kanallarını ölçmek için altın standardı hücre içi organellerdeki standarda uygulamak üç ana zorlukla karşı karşıyadır. İlk olarak, endolizozomların boyutu tipik olarak çok küçüktür (çapı 1 μm'den az), bu da onları mikroskop altında gözlemlemeyi ve izole etmeyi zorlaştırır ve tipik cam mikropipetlerin açılma çapından daha küçüktür, bu da deneyi çalışmaz hale getirir. İkincisi, organel bütünlüğünü korurken endolizozomları doğrudan hedef hücrelerden izole etmek özel beceriler gerektirir. Üçüncüsü, hücre içi organellerde bir hücre iskeletinin olmaması nedeniyle, yama pipeti içindeki endolizozomal zar üzerinde bir conta oluşturmak ve daha sonra tam bir endolizozom konfigürasyonu elde etmek için onu yırtmak, organelin yapısal bütünlüğünü tehlikeye attığı için zor olabilir³.

Bu sorunların üstesinden gelmek için lipid çift katmanlı kayıt, lizozomal hedefleme dizilerinin değiştirilmesi ve katı destekli membran bazlı elektrofizyoloji (SSM veya SSME) teknikleri dahil olmak üzere çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Lipid çift tabakalı kayıt yöntemi, sentetik fosfolipid membranların saflaştırılmış iyon kanalları ile yeniden yapılandırılmasını içerir ve kontrollü koşullar altında membran protein fonksiyonunun ayrıntılı elektrofizyolojik çalışmasını sağlar ^4,5. İyon kanallarındaki lizozomal hedefleme dizilerinin modifiye edilmesi, endolizozomal iyon kanallarının geleneksel yama-kelepçe yöntemleri⁶ kullanılarak ölçüm için plazma zarına yeniden yönlendirilmesini içerir. Endolizozomal düzlemsel yama-kelepçe yöntemi olarak da bilinen katı destekli membran bazlı elektrofizyoloji (SSM veya SSME) teknikleri, mikro yapılı düzlemsel borosilikat yongalarda küçük açıklıklara (<1 μm çapında) sahip katı substrat düzlemsel cam yongaları kullanır. Bu küçük açıklıklı cam yongalar, bir basınç emme kontrol sistemi (Nanion) kullanarak küçük, hatta doğal endolizozomların analizine izin verir. Ancak ilk iki yöntemde iyon kanalları doğal fizyolojik ortamlarında değildir. Plazma zarı üzerinde eksprese edilen veya lipid çift tabakalarına yeniden oluşturulan lizozomal kanalları kaydetme girişimleri büyük ölçüde belirsiz ve çelişkili sonuçlar vermiştir.

Düzlemsel yama-kelepçe teknikleri, yapay girişim konusunu etkili bir şekilde ele almış ve yüksek verimli ölçümlerin avantajını sunmuş olsa da, kullanılan çözümler de bu yöntemle sınırlıdır. Bu makalede tanıtılan endolizozomal yama-klemp tekniği, aynı anda birden fazla hücreyi kaydedebilir ve diğer ölçüm yöntemleriyle kolayca birleştirilebilir. Manuel çalıştırma, hedef vezikülleri görselleştirme avantajı sağlar. Aynı zamanda, endolizozomal membranın bir tarafındaki çözeltideki Ca^{2 +} 'nın kaçınılmaz sınırlamasının üstesinden gelir ve deneysel tasarım^{özgürlüğünü arttırır 3}. Son zamanlarda, endolizozomal yama-klemp teknikleri ilaç geliştirme araştırmalarında anahtar rol oynamaktadır. Örneğin, nörodejeneratif hastalıklarda bu teknik, Alzheimer ve Parkinson hastalıklarıyla ilişkili endolizozomal iyon kanallarını hedef alan yeni ilaçların tanımlanmasına yardımcı olmuştur ^7,8. Araştırmacılar bu tekniği ayrıca tümör hücrelerinde⁹ endolizozomal iyon kanallarının rolünü keşfetmek ve böylece tümör büyümesini ve çoğalmasını kontrol etmek için kullanabilirler. Metabolik hastalıklar ile ilgili olarak, endolizozomal yama-klemp çalışmaları, endolizozomal iyon kanallarını düzenleyen bileşikleri ortaya koymakta, diyabet ve obezite için yeni tedavi yaklaşımları sunmaktadır. Endolizozomal yama-klemp tekniği, endolizozomal disfonksiyonu anlamaya ve potansiyel tedavileri⁶ bulmaya yardımcı olur, endolizozomal iyon kanalı işlevleri hakkındaki anlayışımızı önemli ölçüde geliştirir ve yeni ilaç hedeflerinin keşfini teşvik eder.

Protokol

1. Enstrüman kurulumu

1. Donanım
   NOT: Standart bir elektrofizyoloji teçhizatı kurulumu için Şekil 1'e bakın.
   1. Bir masa ve bir Faraday kafesi kullanarak kurulumu dış müdahalelerden koruyun.
   2. Mikroelektrodu sabit bir şekilde konumlandırmak için mikromanipülatörlü ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın.
   3. Alınan sinyalleri toplamak ve yükseltmek için bir amplifikatör kurun.
   4. Analog sinyalleri dijital sinyallere dönüştürmek için bir sayısallaştırıcı kullanın.
   5. Deneysel protokoller oluşturmak ve toplanan verilerden anlamlı, analiz edilebilir sonuçlar çıkarmak için veri toplama ve analiz yazılımını kullanın.
2. Elektrot -lar
   1. İki elektrot kullanın: bir banyo elektrodu ve bir pipet elektrodu.
      NOT: Platin ve gümüş klorür en iyi polarizasyon özelliklerine sahiptir. Gümüş klorür elektrotları, klorürlenmiş gümüş tel veya peletlerden oluşur, bu nedenle telin veya peletin dış yüzeyinde bir AgCl tabakasına sahiptir (Şekil 2).
3. Pipet hazırlama
   1. Çek -erek
      1. Kılcal boruyu çektirmeye takın.
         NOT: Aşağıda pipet üretimi için kullanılan parametre cihaza özeldir. Bu yazıda kullandığımız alet Malzeme Tablosunda belirtilmiştir.
      2. Isıtıcı filamanı yakmayan deneysel koşullar altında (oda sıcaklığı 22 °C, şekil içi ısıtıcı filament, filamanlı borosilikat cam), cam kılcal damarı eritmek için gereken ısı değerini (HEAT) belirlemek için çektirme üzerinde bir RAMP testi yapın.
      3. HEAT, hız (VEL) ve zaman (TIME) parametrelerini kullanarak altı ayrı çekme döngüsüne sahip yeni bir çekme programı tasarlayın (Tablo 1).
         NOT: HEAT , ısıtıcının filamanını ısıtan ve cam filamanın erimesini sağlayan parametreyi ifade eder. Hız , çektirmenin filamanı her iki yönde çekme hızını gösterir. Zaman , her döngü arasındaki aralığın süresini temsil eder.
      4. Tuş takımındaki yeşil Pull düğmesine basın.
      5. Sıkıştırma düğmesini gevşetin ve pipetleri çektirmeden çıkarın.
      6. Uç çapını, keskinliğini ve geometrisini belirlemek için pipet uçlarını microforge'un göz merceğinin altında inceleyin. Uç çapının 0,5-0,9 μm olduğundan emin olun.
         NOT: Filament daha sık kullanıldıkça cam kılcal damarı eritmek için gereken ısı değeri değişecektir.
      7. Uç boyutu beklentileri karşılamıyorsa, HEAT ve VEL parametrelerini ayarlayın. Daha yüksek sıcaklıklar ve daha yüksek hızlar daha ince, daha uzun uçlar üretecektir ve bunun tersi de geçerlidir. ISITMAYI 5 derecelik artışlarla ve hızı 3 derecelik artışlarla ayarlayın.
   2. Parlatma
      1. Çekilen yama pipetlerini microforge tutucuya yerleştirin.
      2. Pipet uçlarını 35x objektif lensi kullanarak inceleyin (15x mercek ile birlikte 525x büyütme sağlar).
      3. Yama pipetlerini filamente yaklaştırmak için mikromanipülatörü kullanın.
      4. Sıcaklık kadranını 80'e ayarlayın.
      5. Isıtıcıyı açmak için ayak pedalını kullanın ve kısa bir ısı darbesi (1 - 2 sn) uygulayın ve parlatma işlemini microforge göz merceğinden izleyin.
      6. Tüm pipetler parlatılana kadar işlemi tekrarlayın.
      7. Tozun girmesini önlemek için tamamlanan pipetleri kapalı bir kutuya yerleştirin.
         NOT: Amaç, ucu hızlı bir şekilde eritmektir, böylece cam, son uç geometrisini çok keskin hale getirmeden yeniden şekillendirir. Bu, pipetin bastırıldığı vezikül zarına nüfuz etmesini önler ve sızdırmazlık oluşumunu etkili bir şekilde destekler. Son cilayı takiben, pipet ucunun iç yolu çok dar, düz ve doğrusal olmalıdır.
         En iyi kayıt pipetleri, yangınla parlatma işleminden sonra tipik olarak 5 - 8 MΩ dirence sahiptir. Uç açma çapı 2 μm olmalıdır. Başarılı bir gigaseal oluşumu için mükemmel şekilde parlatılmış bir yama pipeti gereklidir, çünkü bu, prosedürün başarısı için çok önemli olan temel tekniklerden biridir.

2. Numune hazırlama

1. Hücre Kültürü (örnek olarak HEK293 kullanılarak)
   1. Hücreleri standart bir nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO₂ ile kültürleyin.
   2. HEK293 hücrelerini% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 100 U / mL penisilin ve 100 mg / mL streptomisin ile desteklenmiş düşük glikozlu DMEM'de kültürleyin.
   3. Poli-L-lizin kaplı 12 mm lamelleri 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin.
2. Organel büyümesi
   1. 24 oyuklu plakadaki (adım 2.1'den itibaren) HEK293 hücrelerine 1 μM vakuolin-1 ekleyin ve genişlemiş veziküller oluşmaya başlayana kadar gece boyunca %5_CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Genişlemiş endolizozomların boyutu, alete, bileşiğin, inkübasyon süresine ve hücre tipine bağlı olarak 1-10 μm'ye ulaşabilir (Şekil 3 ve Tablo 2).
3. Çözelti hazırlama
   NOT: Standart çözelti hazırlama, hücre ve organellerin içindeki iyonik konsantrasyonları simüle etmeyi amaçlar. Örneğin, lizozomlar üzerindeki iyon kanallarını ölçmek için standart çözümler aşağıdaki gibidir:
   1. Banyo çözeltisi hazırlayın (mM cinsinden): 140 K-metansülfonat (MSA), 5 KOH, 4 NaCl, 0.39 CaCl₂, 1 EGTA, 10 HEPES. KOH ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Glikoz ile ozmolariteyi 300 mosm/L'ye ayarlayın.
   2. Pipet çözeltisi hazırlayın (mM cinsinden): 140 Na-MSA, 5 K-MSA, 2 Ca-MSA, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 10 MES. MSA ile pH'ı 4.6'ya ayarlayın. Glikoz ile ozmolariteyi 310 mosm/L'ye ayarlayın.
      NOT: Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden geçirin, 50 mL'lik konik tüplerde 45 mL'lik alikotlar hazırlayın ve bunları 4 °C'de 2-4 haftaya kadar saklayın.

3. Organel izolasyonu

1. 24 oyuklu plakadan işlem görmüş hücrelerle bir lamel çıkarın (bkz. bölüm 2) mikroskop odasına aktarın ve 1 mL banyo solüsyonu ekleyin.
   NOT: Hücreler, endolizozom izolasyonu, sızdırmazlık ve kayıt içeren tüm endolizozomal yama kelepçesi deneyleri için >1 saat banyo solüsyonunda saklanmamalıdır. 1 saat sonra, genişlemiş endolizozomlar küçülür, pipete yapışır ve izole edilmesi zorlaşır.
2. İzolasyon pipetini pipet solüsyonuyla doldurmak için ev yapımı bir plastik doldurma iğnesi kullanın ve pipeti yama kelepçesi kurulumunun ön ucuna takın.
3. Mikromanipülatörün diyagonal hareket açısını 30°'ye yakın olacak şekilde ayarlayın (fabrika varsayılan değeri).
4. Mikroskop altında (40x objektif ve 10x mercek), hücreleri izolasyon için hücre zarı kenarının yakınında bulunan yeterince genişlemiş endozomlar veya lizozomlar açısından inceleyin. İzolasyon pipetini seçili hücreye yaklaştırın.
5. Mikromanipülatörü kullanarak izolasyon pipetini plazma zarının kenarına değene kadar indirin (Şekil 4). Plazma zarının küçük bir parçasını koparmak için izolasyon pipetini hızla yatay olarak hareket ettirin.
6. Aynı pipeti kullanarak, endozomu/lizozomları hücreden ~2 μm mesafeye kadar sıkmak için hücreye karşı taraftan bastırın.
   NOT: Organel üzerinde artık hücre zarı varsa, gigaseal oluşumunu engelleyebilir.
7. İzole edilmiş endolizozomu mikroskop altında inceleyin.

4. Gigaseal oluşumu

1. Yeni parlatılmış bir yama pipetini uygun pipet solüsyonuyla doldurun ve pipeti amplifikatörün ön ucuna takın.
2. Pipete 20 - 50 mbar pozitif basınç uygulayın (veya basınç kontrolü için 1 mL'lik bir şırıngadan 0,03-0,05 mL kullanın) ve bu basıncı koruyun (valfi kilitleyin).
   NOT: 1 mbar (milibar) = 0.001 bar = 0.1 kPa (kilopaskal) = 1 hPa (hektopaskal) = 1.000 dyn/cm2.
3. Pipet ucunu görüş alanının ortasındaki banyo solüsyonuna hareket ettirerek, basıncın banyo solüsyonuna akan sıvıyı görecek kadar yüksek olduğunu onaylayın.
4. Pipet direncini, sızdırmazlık direncini ve seri direnci belirlemek için tekrarlanan akım darbeleri (+ 5 mV; 5 ms) uygulayın. Pipet ucu boyutunu, conta oluşumunu ve tüm endolizozomal konfigürasyonun oluşturulmasını izleyin.
5. Pipeti hızlı bir şekilde hedef vezikülün üst kısmına yaklaştırın. Pipetten gelen sıvı akışı nedeniyle vezikül hareket edene veya yuvarlanana kadar pipeti vezikülün yakınına getirin (Şekil 5).
6. Pipetin ofset voltajını 0 mV'a ayarlayın. Pozitif basıncı hemen serbest bırakın. İdeal olarak, vezikül pipete doğru çekilecek ve zara bağlanacak ve 1 s içinde bir gigaseal (1-20 GΩ) oluşturacaktır.5 mV'luk voltaj darbesi tarafından uyandırılan akım genliğinin <10 pA'ya düşmesine bakın, bu da başarılı gigaseal oluşumunu gösterir.
   NOT: Gigaseal oluşumu için stabil pozitif basınç gereklidir. Bazen, borudaki sızıntılar gigaseal oluşumunu önleyebilir. Sızıntı olmadığından emin olmak için bir manometre kullanılması tavsiye edilir. Bir sızıntı tespit edilirse, sızdırmazlığı iyileştirmek için boruyu yeniden takın veya dikişlere az miktarda vazelin uygulayın.

5. Akım ölçümü

1. Membran kırılması
   NOT: Deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak, elektrot-membran teması dört moda ayrılabilir: hücreye bağlı mod, tüm hücre modu, içten dışa mod ve dıştan dışa mod (Şekil 6).
   1. Tüm vezikül kaydı için, pipet ile organel arasındaki temas noktasında zarı kırmak için 200 μs veya 500 μs'lik yüksek voltajlı kısa darbe (ZAP darbesi) kullanın. Voltajı -500 mV ile -1.200 mV arasında ayarlayın ve membran bozulana kadar her seferinde 100 mV azaltın.
   2. İçten dışa (tek kanallı kayıt) modu için, gigaseal'i oluşturduktan sonra, pipeti organelden uzaklaştırın, zarın küçük bir parçasını koparın ve başlangıçta vezikül lümenine bakan tarafı açığa çıkarın.
   3. Dıştan dışa mod için, gigaseal'ı oluşturduktan ve tüm vezikül moduna geçtikten sonra, pipeti organelden uzaklaştırın, küçük bir veziküler yapıyı korurken zarın küçük bir parçasını koparın.
2. Güncel kayıt
   1. Endolizozomal voltaj-kelepçe yama-kelepçe deneylerinde giriş voltajı değiştiği için endolizozomal membran boyunca akımı kaydedin.
      1. Bu voltajları voltaj adımları veya voltaj rampaları ile kontrol edin; endolizozomal voltaj kelepçesi deneylerinde çok çeşitli giriş voltajları (örneğin, -100 mV ila +100 mV) kullanın.

Sonuçlar

Aşağıda, endolizozomal yama-kelepçe deneyleri sırasında gözlemlenen mevcut şekiller açıklanmaktadır. Mevcut şekil beklendiği gibi değilse, bunun nedeni zayıf temas veya sızıntı olabilir. Referans elektrot banyo solüsyonu ile tam olarak temas etmiyorsa veya pipet elektrodu kırılmak üzereyse zayıf temas meydana gelebilir. Hazne ile lamel arasında sıvının objektif merceğe veya sahneye akmasına izin veren bir boşluk varsa sızıntı meydana gelebilir; Çok fazla...

Tartışmalar

Elektrofizyolojik deney düzeneklerinin dört ana laboratuvar gereksinimi vardır: i) çevre: numuneyi sağlıklı tutmak için kullanılan yöntemler; ii) optik: numuneyi görselleştirme yöntemleri; iii) mekanik: mikroelektrodu stabil bir şekilde konumlandırma yöntemleri; ve iv) elektronik: sinyali yükseltme ve kaydetme yöntemleri.

Endolizozomal yama-kelepçe deneylerini başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için birkaç önemli adım çok öneml...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BOROSILICATE GLASS	SUTTER INSTRUMENT	BF150-75-10	O.D.:1.5 mm, I.D. 0.75 mm 10 cm length, with filament
Digidata 1140A	Axon Instruments
Inverted microscope IX73	OLYMPUS
MODEL P-97 micropipette puller	SUTTER INSTRUMENT
MPC-200	SUTTER INSTRUMENT
MultiClamp 700B	Axon Instruments
POLISHER
Quick Release Chamber	Warner instruments	641943	QR-40LP, for 25 mm Coverslips