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Resumen

Para facilitar la detección rápida y precisa de Acinetobacter baumannii, presentamos un protocolo que emplea la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) junto con la endonucleasa LbaCas12a para identificar infecciones por A. baumannii .

Resumen

Acinetobacter baumannii, una bacteria gramnegativa, es conocida por causar infecciones graves con altas tasas de mortalidad. La detección rápida y precisa de A. baumannii es crucial para un tratamiento oportuno, un control eficaz de la infección y la reducción de la resistencia a los antibióticos. Sin embargo, no existe un método adecuado para la detección rápida y sencilla in situ de A. baumannii. El sistema DNA Endonucleasa Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) ofrece un enfoque rápido, preciso y sensible para la detección de A. baumannii mediante la integración de las capacidades de reconocimiento específicas del objetivo de Cas12a con la eficiencia de amplificación isotérmica de la amplificación de polimerasa recombinasa (RPA). Este protocolo detalla la detección de A. baumannii utilizando RPA combinado con endonucleasa LbaCas12a. En este artículo se describen los siguientes pasos: extracción de ADN, selección de una secuencia de ADN específica, diseño de cebador y ARN CRISPR (crRNA), construcción de plásmido recombinante positivo, configuración del ensayo Cas12a-RPA, optimización del sistema de amplificación de RPA, visualización del ensayo RPA-CRISPR/Cas12a utilizando una herramienta de detección de fluorescencia como un instrumento de PCR en tiempo real, y la evaluación de la sensibilidad y la evaluación de la especificidad.

Introducción

En microbiología clínica, la detección de infecciones por Acinetobacter baumannii presenta un desafío importante. Esta bacteria gramnegativa puede causar infecciones con síntomas clínicos graves, incluso con altas tasas de mortalidad, especialmente entre pacientes inmunocomprometidos1. Los métodos tradicionales de detección de infecciones por patógenos basados en cultivos requieren mucho tiempo y pueden carecer de sensibilidad, lo que puede retrasar el tratamiento con antibióticos y comprometer los resultados de los pacientes. La identificación rápida y precisa de A. baumannii es crucial para un tratamiento eficaz y el control de los brotes. Se han explorado técnicas moleculares que emplean la amplificación de ácidos nucleicos para satisfacer esta necesidad. Sin embargo, estos enfoques a menudo requieren equipos sofisticados de ciclo térmico y pueden estar limitados por técnicos bien capacitados y laboratorios bien establecidos. Para superar estos desafíos, la investigación se centra cada vez más en el desarrollo de métodos de amplificación isotérmica 2,3,4.

La amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) es un método establecido por Piepenburg et al 5 y utilizado para amplificar el ADN, de forma similar a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pero sin necesidad de ciclos de temperatura. Este método incluye 50 mM de Tris (pH 7,5), 100 mM de acetato de potasio, 14 mM de acetato de magnesio, 2 mM de DTT, 5% de PEG20000 (un polietilenglicol de alto peso molecular), 200 μM dNTPs, 3 mM de ATP, 50 mM de fosfocreatina, 100 μg/mL de creatina quinasa, 120 μg/mL de UvsX, 30 μg/mL de UvsY, 900 μg/mL de Gp32, 30 μg/mL de Bsu LF, Imprimaciones de 450 nM y plantillas de ADN. El proceso de amplificación comienza con la unión de la proteína recombinasa UvsX a los cebadores en presencia de 3 mM de ATP y 5% PEG20000 formando un complejo de recombinasa-cebador. Este complejo facilita la combinación de cebadores con las secuencias homólogas en el ADN bicatenario.

Con la ayuda de UvsY, la recombinasa UvsX facilita el intercambio entre el cebador y la hebra moldura, lo que resulta en el desplazamiento de una hebra del ADN objetivo. Gp32 ayuda a mantener la estructura de ADN monocatenario. Finalmente, la recombinasa se disocia y una ADN polimerasa (Bsu LF) capaz de desplazar las hebras de ADN se une al extremo 3' del cebador, alargándolo en presencia de trifosfatos desoxirribonucleósidos (dNTP). Este proceso se repite cíclicamente, logrando una amplificación exponencial. Todos los procesos de amplificación pueden completarse en 20-40 minutos y a temperaturas relativamente constantes entre 37 °C y 42 °C. Este rango de temperatura es aproximadamente idéntico a las temperaturas fisiológicas, lo que permite que la RPA se lleve a cabo en un entorno minimalista, lo que la convierte en una herramienta versátil y eficiente para la detección y el análisis de ADN.

El sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) y las proteínas asociadas a CRISPR (CRISPR-Cas) funcionan como un mecanismo inmunológico adaptativo en bacterias y arqueas, que abarca sistemas de Clase I y Clase II. La clase II incluye proteínas como Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) y Cas14, que identifican y escinden el ADN o ARN diana guiado por ARN CRISPR (crRNA)6,7,8 . LbaCas12a (o Cpf1) es una endonucleasa de ADN guiada por crRNA. El crRNA sirve como ARN guía dentro del sistema CRISPR-Cas, donde se compleja con las proteínas Cas. Aprovecha su región espaciadora para emparejarse con el ADN objetivo, dirigiendo eficazmente el complejo proteico a las secuencias objetivo. La secuencia 5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3' sirve como la repetición de crRNA conservada, un elemento constante en todos los crRNAs de LbaCas12a. Después de esta repetición hay un segmento específico del objetivo que difiere en función del objetivo de ADN previsto. Esta secuencia de diana oscila entre 18 y 24 nucleótidos de longitud.

La secuencia PAM (Protospacer-Adjacent Motif) (TTTV, donde V puede ser A, C o G) se encuentra en el extremo 5' de la hebra no complementaria del objetivo de ADN. El Cas12a corta el ADN bicatenario objetivo en la secuencia PAM. Posteriormente, las proteínas Cas activadas ejecutan una transescisión inespecífica del ADN monocatenario (ssDNA)9,10,11,12. Por lo tanto, el ssDNA marcado con un fluoróforo y un extintor sufre una escisión, lo que resulta en la emisión de una señal fluorescente después de la escisión colateral 8,13. La intensidad de fluorescencia se puede cuantificar utilizando un lector de fluorescencia para la detección precisa de ácidos nucleicos14. En particular, Cas12a se utiliza ampliamente para el análisis de ADN, con su unión y escisión de secuencias objetivo supeditadas al reconocimiento del motivo adyacente al protoespaciador (PAM), mientras que Cas13a opera independientemente de tal requisito.

Los sistemas CRISPR-Cas 15,16,17 facilitan la escisión dentro de una sola reacción 18,19,20,21. La combinación de los dos anteriores puede crear una herramienta robusta conocida como A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) para la detección de ácidos nucleicos22,23,24. Este protocolo demuestra el uso de RPA junto con la actividad de la DNasa de Cas12a para dirigirse y escindir específicamente una secuencia guiada por crRNA dentro del gen de ADNr 16s de A. baumannii, lo que permite una detección sensible y precisa del patógeno.

El método A. baumannii-DETECTR presenta varias ventajas frente a los métodos convencionales de detección25,26. En primer lugar, la característica isotérmica de RPA agiliza los procedimientos operativos y reduce los costos a través de su mecanismo de amplificación independiente del termociclador5. En segundo lugar, la endonucleasa Cas12a aumenta la especificidad del ensayo mediante la focalización mediada por crRNA y el emparejamiento de bases de Watson-Crick7. Por último, el uso del método de un tubo de A. baumannii-DETECTR no solo ahorra tiempo, sino que también reduce significativamente el riesgo de contaminación por amplicones19.

El protocolo describe los pasos para la extracción de ADN, la selección de secuencias de ADN objetivo, el diseño de cebadores y crRNA, la construcción de plásmidos recombinantes positivos, el establecimiento de la configuración del ensayo Cas12a-RPA, la optimización de la optimización de la amplificación de RPA y la visualización de los resultados con el uso de herramientas de instrumentos de detección de fluorescencia como una máquina de PCR en tiempo real, Completo con evaluaciones de sensibilidad y especificidad.

El método A. baumannii-DETECTR es prometedor para mejorar los resultados de los pacientes al facilitar el tratamiento oportuno y eficaz, el control sólido de la infección y la contención de la propagación de la resistencia a los antibióticos. Este protocolo puede servir como una guía integral para la implementación de la tecnología Cas12a-RPA, mejorando su utilidad en diversos entornos de atención médica. Sin embargo, es crucial tener en cuenta que cada paso debe optimizarse en función de las condiciones específicas del laboratorio y la variedad de muestras para garantizar resultados consistentes y confiables.

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Protocolo

1. Construcción del A. baumannii -DETECTR

NOTA: La construcción de A. baumannii-DETECTR es un proceso de cuatro pasos que involucra el diseño de cebadores y crRNA, la construcción de plásmidos recombinantes positivos, la preparación de soluciones de reacción, la amplificación isotérmica de ADN por RPA y la visualización del ensayo RPA-CRISPR/Cas12a. El esquema del ensayo DETECTR se ilustra en la Figura 1.

  1. Diseño de cebador y crRNA (ver Archivo Suplementario 1)
    1. Diseñe 12 pares de imprimaciones utilizando herramientas de diseño sobre la base de los principios de diseño de imprimación. Obtenga cuatro cebadores delanteros (F0-F3) y tres cebadores inversos (R1-R3) para componer doce pares de cebadores (F0R1, F0R2, F0R3, F1R1, F1R2, F1R3, F2R1, F2R2, F2R3, F3R1, F3R2, F3R3).
      1. Asegúrese de que el extremo 5' del cebador contenga bases C o T dentro de los primeros 3-5 nucleótidos en lugar de un estiramiento G continuo. Además, asegúrese de que los últimos tres nucleótidos en el extremo 3' sean idealmente bases G y C para mejorar la amplificación.
      2. Diseñe cebadores sin secuencias autocomplementarias para evitar la formación de horquillas y con no más de cuatro bases complementarias u homólogas entre ellas. Manténgase alejado de la complementariedad del extremo 3' para evitar la dimerización del cebador.
    2. Evalúe la especificidad de cada par de cebadores utilizando la herramienta Primer-BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) para evaluar la eficacia y especificidad de los cebadores.
      NOTA: Primer-BLAST puede utilizar la base de datos del NCBI para encontrar secuencias que coincidan con los cebadores diseñados, lo que ayuda a los usuarios a evaluar la eficacia y especificidad de los cebadores.
    3. Después del cribado del cebador, diseñe el ARN CRISPR (crRNA) o el ARN guía (gRNA) utilizando la secuencia de andamiaje de crRNA LbaCas12a (5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3') como secuencia fija. Incorpore un segmento específico del objetivo (5'-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3'), asegurándose de que el motivo PAM se ubique en el extremo 5' del hilo no complementario.
      NOTA: Las secuencias de todos los oligonucleótidos y crRNA se presentan en la Tabla 1.
  2. Construcción de plásmidos recombinantes positivos
    1. Amplifique el segmento de ADNr 16s utilizando el conjunto de cebadores A. baumannii 16s rDNA-F (cebador directo) y A. baumannii 16s rDNA-R (cebador inverso).
      1. Agregue 1 μL de 10 μM F y 10 μM R, 10 μL de tampón de pFu rápido5x, 1 μL de polimerasa pFu rápida, 4 μL de dNTP de 2,5 mM, 1 μL de ADN genómico de A . baumannii de 10 ng/μL y 32 μL de agua libre de nucleasa al sistema de PCR de 50 μL.
      2. Ajuste las condiciones de ciclo de PCR de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguida de 33 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, recocido a 55 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 1 min y 20 s. Finalmente, realice 10 min a 72°C para la extensión final.
    2. Para purificar el producto de PCR positivo, utilice un kit de purificación de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, clona el ADN purificado en el vector pUC57, que se ha digerido con las enzimas BamHI y SalI.
      NOTA: Este proceso dará como resultado la creación de un plásmido recombinante positivo que contiene una región conservada.
    3. Diluir el plásmido recombinante positivo en serie en incrementos de diez veces con ddH2O esterilizado para lograr una concentración de una copia/μL a 107 copias/μL. Almacene el plásmido diluido a -20 °C para experimentos posteriores.
  3. Preparación de la solución
    1. Prepare la solución A de la siguiente manera: para cada reacción, agregue 29,5 μL de tampón de rehidratación sin cebador, 2,4 μL de 10 μM de A. baumannii-F y 10 μM de A. baumannii-R, y 12,2μL de ddH2O para lograr un volumen final de 46,5 μL. de vórtice y gire brevemente. A continuación, agregue la mezcla de reacción a los tubos de reacción enzimática del kit RPA. Pipeta para mezclar.
      NOTA: Los cebadores de A. baumannii-F y R se utilizan en el ensayo que se dirige al gen de A. baumannii . Consulte la Tabla 1 para ver la secuencia.
    2. Prepare la solución B de la siguiente manera: para cada reacción, agregue 0,24 μL de 10 μM de ssDNA reportero, 2 μL de tampón de reacción Cas12a 10x, 1 μL de ARNcr de 1 μM, 1 μL de Cas12a de 1 μM y 10,76μL de ddH2O para lograr un volumen final de 15 μL.
      NOTA: Las sondas (ssDNA reporter) se compraron y consistían en un reportero de ADN monocatenario que se marcó con un fluoróforo de 5-carboxifluoresceína (FAM) en el extremo 5' y un extintor Black Hole Quencher 1 (BHQ1) en el extremo 3'. En el caso de que sea necesario detectar numerosas muestras, prepare una cantidad sustancial de solución B y, a continuación, divida las muestras en alícuotas.
  4. Amplificación isotérmica de ADN (RPA)
    1. Añadir 1 μL del plásmido recombinante positivo de 107 copias/μL a la solución A con diferentes pares de cebadores; Homogeneizar. A continuación, añade 2,5 μL de 280 mM de acetato de magnesio (MgOAc) a la solución y mezcla bien.
      NOTA: Las reacciones de RPA comienzan tan pronto como se agrega MgOAc.
    2. Incubar a 39 °C durante 20 min. Después de 20 minutos, purifique los productos amplificados con diferentes cebadores utilizando RPA con un kit de purificación, y luego ejecute los amplicones limpios en un gel de agarosa al 1% a 120 V durante 10 minutos para seleccionar la banda más brillante y ancha como el mejor par de cebadores.
      NOTA: Para un número bajo de copias de plantilla, después de 4 minutos, retire el tubo EP, el vórtice y gire brevemente; Luego reemplácelo en el dispositivo de calefacción durante otros 16 minutos. Después de la amplificación, los tubos deben abrirse con extrema precaución para evitar contaminar las superficies de trabajo con amplicones. Esta precaución reducirá el riesgo de inducir resultados falsos positivos en procedimientos experimentales posteriores.
  5. Optimización del sistema de amplificación RPA
    NOTA: El par de cebadores óptimo F3R3 seleccionado en el paso anterior se estableció en diferentes concentraciones finales para la reacción de amplificación de RPA a fin de descartar la concentración y el tiempo óptimos del cebador. NC es un control en blanco para la concentración de cebador correspondiente.
    1. Mantener constantes las concentraciones de los demás componentes y el volumen total de 46,5 μL en la solución A. Ajustar el volumen de ddH2O libre de RNasa en consecuencia para lograr las concentraciones finales de cebadores de 10 μM F3 y 10 μM R3 a 0,40 μM (2,0 μL), 0,44 μM (2,2 μL), 0,48 μM (2,4 μL) y 0,52 μM (2,6 μL), respectivamente.
    2. Incubar a 39 °C durante diferentes tiempos: 10 min, 20 min, 30 min.
    3. Limpie los productos RPA con un kit de purificación de ADN y realice la electroforesis en un gel de agarosa al 1% a 120 V durante 10 min para identificar la concentración óptima de cebadores y los tiempos de incubación mediante el análisis de las características de las bandas.
  6. Visualización del ensayo RPA-CRISPR/Cas12a
    1. Añadir 5 μL del producto RPA en la solución B y mezclar bien hasta que quede homogéneo.
    2. Coloque las muestras en el instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia, configure el canal FAM y lea los valores cada minuto durante 60 min a 37 °C, 60x durante un total de 60 min.
      NOTA: La señal de fluorescencia verde puede durar varios días. Para asegurarse de que el sistema funcione de manera efectiva, es mejor realizar una prueba libre de ADN y ARNasa.

2. Evaluación de la especificidad de la plataforma de detección basada en RPA-CRISPR/Cas12a

NOTA: Para probar la especificidad de A. baumannii-DETECTR, los ácidos nucleicos de A. baumannii, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Rickettsia mooseri, Enterobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Chlamydia psittaci, Legionella, Cockerella burnetii, Serratia y muestras humanas se sometieron a la prueba DETECTR.

  1. Utilice plantillas de ADN obtenidas de varias especies utilizando el kit de ADN al que se hace referencia o aislándolas hirviendo las bacterias en el agua. Asegúrese de que todas las plantillas tengan las mismas concentraciones. Usa el agua como un control negativo.
  2. Agregue 10 ng o 1 μL de plantillas de ADN a la solución A que contiene cebadores F3R3. Añadir 2,5 μL de MgOAc, mezclar bien e incubar la mezcla a 39 °C durante 20 min.
  3. Pasados 20 min, añadir 5 μL del producto del paso anterior a la solución B y mezclar.
  4. Coloque en el instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia, ajuste el canal a FAM y lea el valor una vez por minuto a 37 °C, para un total de 60 x durante 60 minutos.

3. Evaluación de la sensibilidad de la plataforma de detección basada en RPA-CRISPR/Cas12a

  1. Utilice un plásmido recombinante positivo, que se haya preparado a una concentración de 1-107 copias/μL, como molde para la reacción. Utilice agua para el control negativo.
  2. Realice el método siguiendo los pasos 2.2-2.4.
    NOTA: El conjunto de cebadores RPA-F3 y RPA-R3 está diseñado para amplificar un fragmento más corto de 174 pares de bases del plásmido recombinante positivo.

4. Preparativos mientras la muestra está bajo luz ultravioleta y detección de LFS

  1. Saque la cantidad requerida de tiras reactivas y etiquételas adecuadamente.
  2. Transfiera 10 μL de los productos amplificados de los pasos 2 y 3 a tubos de PCR separados, respectivamente. A continuación, añade 40 μL de ddH2O a cada tubo.
    NOTA: Si se utiliza un sistema de reacción preparado por uno mismo, se recomienda explorar la proporción óptima de dilución.
  3. Realiza la prueba.
    1. Someter el tubo de PCR que contiene los productos amplificados a un transiluminador para evaluar la presencia de fluorescencia.
    2. Inserte las tiras reactivas en los tubos de PCR con el extremo de la almohadilla de muestra hacia abajo.
    3. Déjalo reposar a temperatura ambiente durante 5-10 minutos para leer el resultado. Después de este tiempo, asegúrese de que el nivel de líquido no exceda la línea máxima antes de continuar.
    4. Interprete los resultados como negativos si la línea T no muestra color. Interprete los resultados como positivos si la línea T es visible a simple vista, lo que indica que la sonda de ácido nucleico ha sido escindida por la enzima Cas y la enzima Cas ha sido activada. Considere que el resultado no es válido si ni la línea C ni la línea T muestran color.

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Resultados

En este estudio, presentamos una novedosa plataforma de diagnóstico portátil llamada A. baumannii-DETECTR, que integra la eficiencia de amplificación isotérmica de RPA y el sistema CRISPR-Cas12a para la identificación de campo rápida y confiable de A. baumannii. El esquema del ensayo DETECTR se ilustra en la Figura 1.

Se diseñaron doce pares...

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Discusión

Los métodos tradicionales de diagnóstico para las infecciones por A. baumannii tienen varias restricciones que los hacen menos accesibles y factibles para las pruebas en el punto de atención27. Por ejemplo, la PCR tiene buena sensibilidad y especificidad, pero requiere equipos especializados en ciclos térmicos y flujos de trabajo complejos que deben ser operados por profesionales. El novedoso método presentado aquí, que combina la edición del genom...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto del Plan de Desarrollo de Ciencia y Tecnología de la provincia de Jilin, China (20240305027YY) y el Departamento de Finanzas de la provincia de Jilin (JLSWSRCZX2023-55, JLSWSRCZX2021-041).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
 -20 °C FreezerHaierHYCD-290China
Agarose BasicBioFroxx1110GR100China
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by companywww.comatebio.com
Cas12a cutting substrate - ssDNA - fluorescent typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BHQChina
Cas12a cutting substrate - ssDNA - test paper typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BIOChina
Electrophoresis apparatusBIO-RADPOWER PAC1000USA
Fluorescence quantitative PCR instrumentBIO-RADCFX ConnectUSA
Gel Imaging SystemBIO-RADGel Doc 2000USA
https://ezassay.com/rna
https://www.ezassay.com/primer  
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM)EZassay Biotech. Co. Ltd.HD-FMBOChina
LbaCas12a (Cpf1) enhanced proteinEZassay Biotech. Co. Ltd.CAS-12E-001China
LED TransilluminatorLABGICBL-20China
Magnesium acetate, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
MicrocentrifugeallshengMini-6kChina
PCR strip tubesPCR strip tubesPST-0208-FT-CChina
TGrade Dry Bath IncubatorTiangen biochemical technology OSE-DB-01China
Tianamp Bacteria DNA KitTiangen biochemical technology DP302-02China
TIANamp Bacteria DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD.DP302 China 
TransStart FastPfu DNA Polymerase TransGen Biotech. Co. Ltd.AP221 China 
TwistAmp Basic KitTwistDXTABAS03KITUK
Universal DNA Purification KitTiangen biochemical technology DP214-03China

Referencias

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