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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Per facilitare la rilevazione rapida e precisa di Acinetobacter baumannii, presentiamo un protocollo che impiega l'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) in combinazione con l'endonucleasi LbaCas12a per identificare le infezioni da A. baumannii.

Abstract

L'Acinetobacter baumannii, un batterio gram-negativo, è noto per causare gravi infezioni con alti tassi di mortalità. Il rilevamento rapido e accurato di A. baumannii è fondamentale per un trattamento tempestivo, un controllo efficace delle infezioni e la riduzione della resistenza agli antibiotici. Tuttavia, non esiste un metodo adatto per il rilevamento rapido e semplice in loco di A. baumannii. Il sistema CRISPR Trans Reporter (DETECTR) mirato all'endonucleasi del DNA offre un approccio rapido, preciso e sensibile al rilevamento di A. baumannii , integrando le capacità di riconoscimento specifiche del bersaglio di Cas12a con l'efficienza di amplificazione isotermica dell'amplificazione della ricombinasi polimerasi (RPA). Questo protocollo descrive in dettaglio la rilevazione di A. baumannii utilizzando RPA combinata con l'endonucleasi LbaCas12a. In questo articolo vengono descritte le seguenti fasi: estrazione del DNA, selezione di una specifica sequenza di DNA, progettazione del primer e dell'RNA CRISPR (crRNA), costruzione di un plasmide ricombinante positivo, configurazione del test Cas12a-RPA, ottimizzazione del sistema di amplificazione RPA, visualizzazione del test RPA-CRISPR/Cas12a utilizzando uno strumento di rilevamento della fluorescenza come uno strumento di PCR in tempo reale, e valutazione della sensibilità e della specificità.

Introduzione

In microbiologia clinica, l'individuazione delle infezioni da Acinetobacter baumannii rappresenta una sfida significativa. Questo batterio gram-negativo può causare infezioni con gravi sintomi clinici, anche con alti tassi di mortalità, in particolare tra i pazienti immunocompromessi1. I metodi tradizionali di rilevamento delle infezioni da agenti patogeni basati su colture richiedono molto tempo e possono mancare di sensibilità, il che può ritardare il trattamento antibiotico e compromettere gli esiti dei pazienti. L'identificazione rapida e accurata di A. baumannii è fondamentale per un trattamento efficace e il controllo dell'epidemia. Per soddisfare questa esigenza sono state esplorate tecniche molecolari che impiegano l'amplificazione degli acidi nucleici. Tuttavia, questi approcci richiedono spesso sofisticate apparecchiature per i cicli termici e possono essere limitati da tecnici ben addestrati e laboratori consolidati. Per superare queste sfide, la ricerca è sempre più focalizzata sullo sviluppo di metodi di amplificazione isoterma 2,3,4.

L'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) è un metodo stabilito da Piepenburg et al 5 e utilizzato per amplificare il DNA, simile alla reazione a catena della polimerasi (PCR) ma senza la necessità di cicli di temperatura. Questo metodo include 50 mM di Tris (pH 7,5), 100 mM di acetato di potassio, 14 mM di acetato di magnesio, 2 mM di DTT, 5% PEG20000 (un polietilenglicole ad alto peso molecolare), 200 μM di dNTP, 3 mM di ATP, 50 mM di fosfocreatina, 100 μg/mL di creatina chinasi, 120 μg/mL di UvsX, 30 μg/mL di UvsY, 900 μg/mL di Gp32, 30 μg/mL di Bsu LF, 450 nM primer e modelli di DNA. Il processo di amplificazione inizia con il legame della proteina ricombinasi UvsX ai primer in presenza di 3 mM di ATP e 5% di PEG20000 formando un complesso ricombinasi-primer. Questo complesso facilita quindi la combinazione di primer con le sequenze omologhe sul DNA a doppio filamento.

Con l'aiuto di UvsY, la ricombinasi UvsX facilita lo scambio tra il primer e il filamento stampo, con conseguente spostamento di un filamento del DNA bersaglio. Gp32 aiuta a mantenere la struttura del DNA a filamento singolo. Infine, la ricombinasi si dissocia, e una DNA polimerasi (Bsu LF) in grado di spostare i filamenti di DNA si lega all'estremità 3' del primer, allungandolo in presenza di desossiribonucleosidi trifosfati (dNTP). Questo processo si ripete ciclicamente, ottenendo un'amplificazione esponenziale. Tutti i processi di amplificazione possono essere completati entro 20-40 minuti e a temperature relativamente costanti tra 37 °C e 42 °C. Questo intervallo di temperatura è approssimativamente identico alle temperature fisiologiche, il che consente di condurre l'RPA in un ambiente minimalista, rendendo l'RPA uno strumento versatile ed efficiente per il rilevamento e l'analisi del DNA.

Il sistema CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) e CRISPR-Associated Protein (CRISPR-Cas) funziona come meccanismo immunitario adattativo nei batteri e negli archei, comprendendo i sistemi di Classe I e Classe II. La classe II include proteine come Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) e Cas14, che identificano e separano il DNA o l'RNA bersaglio guidati dall'RNA CRISPR (crRNA)6,7,8 . LbaCas12a (o Cpf1) è un'endonucleasi del DNA guidata da crRNA. Il crRNA funge da RNA guida all'interno del sistema CRISPR-Cas, dove si complessano con le proteine Cas. Sfrutta la sua regione spaziatrice per accoppiarsi con il DNA bersaglio, guidando efficacemente il complesso proteico verso le sequenze bersaglio. La sequenza 5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3' funge da ripetizione conservata del crRNA, un elemento costante in tutti i crRNA di LbaCas12a. A seguito di questa ripetizione c'è un segmento specifico del bersaglio che differisce in base al bersaglio del DNA previsto. Questa sequenza di targeting varia da 18 a 24 nucleotidi di lunghezza.

La sequenza PAM (Protospacer-Adjacent Motif) (TTTV, dove V può essere A, C o G) si trova all'estremità 5' del filamento non complementare del bersaglio del DNA. Il Cas12a taglia il DNA bersaglio a doppio filamento nella sequenza PAM. Successivamente, le proteine Cas attivate eseguono la trans-scissione non specifica del DNA a singolo filamento (ssDNA)9,10,11,12. Pertanto, l'ssDNA marcato con un fluoroforo e un quencher subisce la scissione, con conseguente emissione di un segnale fluorescente a seguito della scissione collaterale 8,13. L'intensità della fluorescenza può essere quantificata utilizzando un lettore di fluorescenza per una rilevazione precisa dell'acido nucleico14. In particolare, Cas12a è ampiamente utilizzato per l'analisi del DNA, con il suo legame e la scissione delle sequenze bersaglio subordinate al riconoscimento del motivo adiacente al protospaziatore (PAM), mentre Cas13a opera indipendentemente da tale requisito.

I sistemi CRISPR-Cas 15,16,17 facilitano la scissione all'interno di una singola reazione 18,19,20,21. La combinazione dei due precedenti può creare uno strumento robusto noto come A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) per il rilevamento degli acidi nucleici 22,23,24. Questo protocollo dimostra l'uso dell'RPA in combinazione con l'attività della DNasi di Cas12a per colpire e scindere in modo specifico una sequenza guidata da crRNA all'interno del gene 16s rDNA di A. baumannii, consentendo così un rilevamento sensibile e preciso del patogeno.

Il metodo A. baumannii-DETECTR presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi di rilevamento convenzionali25,26. In primo luogo, la caratteristica isotermica dell'RPA semplifica le procedure operative e riduce i costi grazie al suo meccanismo di amplificazione indipendente dal termociclatore5. In secondo luogo, l'endonucleasi Cas12a aumenta la specificità del saggio per mezzo del targeting mediato da crRNA e dell'accoppiamento di basi Watson-Crick7. Infine, l'utilizzo del metodo a una provetta di A. baumannii-DETECTR non solo consente di risparmiare tempo, ma riduce anche significativamente il rischio di contaminazione da ampliconi19.

Il protocollo delinea le fasi per l'estrazione dell'estrazione del DNA, la selezione delle sequenze di DNA bersaglio, la progettazione di primer e crRNA, la costruzione di plasmidi ricombinanti positivi, l'istituzione dell'impostazione del test Cas12a-RPA, l'ottimizzazione dell'ottimizzazione dell'amplificazione RPA e la visualizzazione dei risultati con l'utilizzo di strumenti di rilevamento della fluorescenza come una macchina per PCR in tempo reale, completo di valutazioni di sensibilità e specificità.

Il metodo A. baumannii-DETECTR è promettente nel migliorare gli esiti dei pazienti facilitando un trattamento tempestivo ed efficace, un robusto controllo delle infezioni e il contenimento della diffusione della resistenza agli antibiotici. Questo protocollo può fungere da linea guida completa per l'implementazione della tecnologia Cas12a-RPA, migliorandone l'utilità in vari contesti sanitari. Tuttavia, è fondamentale notare che ogni passaggio deve essere ottimizzato in base alle condizioni di laboratorio specifiche e alla varietà di campioni per garantire risultati coerenti e affidabili.

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Protocollo

1. Costruzione del DETECTR A. baumannii

NOTA: La costruzione di A. baumannii-DETECTR è un processo in quattro fasi che coinvolge la progettazione di primer e crRNA, la costruzione di plasmidi ricombinanti positivi, la preparazione di soluzioni di reazione, l'amplificazione isotermica del DNA mediante RPA e la visualizzazione del saggio RPA-CRISPR/Cas12a. Lo schema del test DETECTR è illustrato nella Figura 1.

  1. Progettazione del primer e del crRNA (vedi File supplementare 1)
    1. Progetta 12 coppie di primer utilizzando strumenti di progettazione sulla base dei principi di progettazione del primer. Procurarsi quattro primer in avanti (F0-F3) e tre primer inversi (R1-R3) per comporre dodici coppie di primer (F0R1, F0R2, F0R3, F1R1, F1R2, F1R3, F2R1, F2R2, F2R3, F3R1, F3R2, F3R3).
      1. Assicurarsi che l'estremità 5' del primer contenga basi C o T all'interno dei primi 3-5 nucleotidi invece di un tratto G continuo. Inoltre, assicurati che gli ultimi tre nucleotidi all'estremità 3' siano idealmente basi G e C per migliorare l'amplificazione.
      2. Progettare primer senza sequenze autocomplementari per evitare la formazione di forcine e con non più di quattro basi complementari o omologhe tra di loro. Evitare la complementarietà dell'estremità 3' per evitare la dimerizzazione dell'innesco.
    2. Valutare la specificità di ciascuna coppia di primer utilizzando lo strumento Primer-BLAST del National Center for Biotechnology Information (NCBI) per valutare l'efficacia e la specificità dei primer.
      NOTA: Primer-BLAST può utilizzare il database NCBI per trovare sequenze che corrispondono ai primer progettati, aiutando gli utenti a valutare l'efficacia e la specificità dei primer.
    3. Dopo lo screening del primer, progettare l'RNA CRISPR (crRNA) o l'RNA guida (gRNA) utilizzando la sequenza di scaffold crRNA LbaCas12a (5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3') come sequenza fissa. Incorporare un segmento specifico per il bersaglio (5'-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3'), assicurandosi che il motivo PAM si trovi all'estremità 5' del filamento non complementare.
      NOTA: Le sequenze di tutti gli oligonucleotidi e crRNA sono presentate nella Tabella 1.
  2. Costruzione di plasmidi ricombinanti positivi
    1. Amplificare il segmento di rDNA 16s utilizzando il set di primer A. baumannii 16s rDNA-F (primer diretto) e A. baumannii 16s rDNA-R (primer inverso).
      1. Aggiungere 1 μL di 10 μM F e 10 μM R, 10 μL di 5x tampone pFu veloce, 1 μL di pFu polimerasi veloce, 4 μL di 2,5 mM dNTP, 1 μL di 10 ng/μL di DNA genomico di A. baumannii e 32 μL di acqua priva di nucleasi al sistema PCR da 50 μL.
      2. Impostare le condizioni del ciclo PCR come segue: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 minuti, seguita da 33 cicli di denaturazione a 95 °C per 30 secondi, ricottura a 55 °C per 30 secondi ed estensione a 72 °C per 1 minuto e 20 secondi. Infine, eseguire 10 minuti a 72°C per l'estensione finale.
    2. Per purificare il prodotto PCR positivo, utilizzare un kit di purificazione del DNA secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, clonare il DNA purificato nel vettore pUC57, che è stato digerito con gli enzimi BamHI e SalI.
      NOTA: Questo processo porterà alla creazione di un plasmide ricombinante positivo contenente una regione conservata.
    3. Diluire il plasmide ricombinante positivo in serie con incrementi di dieci volte con ddH2O sterilizzato per ottenere una concentrazione da una copia/μL a 107 copie/μL. Conservare il plasmide diluito a -20 °C per esperimenti successivi.
  3. Preparazione della soluzione
    1. Preparare la soluzione A come segue: per ogni reazione, aggiungere 29,5 μL di tampone di reidratazione senza primer, 2,4 μL di 10 μM di A. baumannii-F e 10 μM di A. baumannii-R e 12,2μL di ddH2O per ottenere un volume finale di 46,5 μL. Vortice e centrifugare brevemente. Quindi, aggiungere la miscela di reazione alle provette di reazione enzimatica del kit RPA. Pipetta per mescolare.
      NOTA: I primer di A. baumannii-F e R sono utilizzati nel test che ha come bersaglio il gene di A. baumannii . Fare riferimento alla Tabella 1 per la sequenza.
    2. Preparare la soluzione B come segue: per ogni reazione, aggiungere 0,24 μL di 10 μM ssDNA reporter, 2 μL di 10x Cas12a Reaction Buffer, 1 μL di 1 μM crRNA, 1 μL di 1 μM Cas12a e 10,76μL di ddH2O per ottenere un volume finale di 15 μL.
      NOTA: Le sonde (ssDNA reporter) sono state acquistate e consistevano in un reporter di DNA a singolo filamento che è stato marcato con un fluoroforo 5-carbossifluoresceina (FAM) all'estremità 5' e un quencher Black Hole Quencher 1 (BHQ1) all'estremità 3'. Nel caso di numerosi campioni da rilevare, preparare una notevole quantità di soluzione B e poi dividere i campioni in aliquote in un secondo momento.
  4. Amplificazione isotermica del DNA (RPA)
    1. Aggiungere 1 μL del plasmide ricombinante positivo di 107 copie/μL alla soluzione A con diverse coppie di primer; Mescolare accuratamente. Quindi, aggiungere 2,5 μl di 280 mM di acetato di magnesio (MgOAc) alla soluzione e mescolare bene.
      NOTA: Le reazioni RPA iniziano non appena viene aggiunto MgOAc.
    2. Incubare a 39 °C per 20 min. Dopo 20 minuti, purificare i prodotti amplificati con diversi primer utilizzando RPA con un kit di purificazione, quindi eseguire gli ampliconi puliti su un gel di agarosio all'1% a 120 V per 10 minuti per selezionare la banda più luminosa e più ampia come la migliore coppia di primer.
      NOTA: Per un numero di copie del modello basso, dopo 4 minuti, rimuovere il tubo EP, vortice e centrifugare brevemente; Quindi riposizionarlo nel dispositivo di riscaldamento per altri 16 minuti. Dopo l'amplificazione, i tubi devono essere aperti con estrema cautela per evitare di contaminare le superfici di lavoro con gli ampliconi. Questa precauzione ridurrà il rischio di indurre risultati falsi positivi nelle successive procedure sperimentali.
  5. Ottimizzazione del sistema di amplificazione RPA
    NOTA: La coppia di primer ottimale F3R3 selezionata nel passaggio precedente è stata impostata su diverse concentrazioni finali per la reazione di amplificazione RPA per escludere la concentrazione e il tempo ottimali del primer. NC è un controllo in bianco per la corrispondente concentrazione di primer.
    1. Mantenere costanti le concentrazioni degli altri componenti e il volume totale di 46,5 μL nella soluzione A. Regolare di conseguenza il volume di ddH2O privo di RNasi per ottenere le concentrazioni finali del primer di 10 μM F3 e 10 μM R3 a 0,40 μM (2,0 μL), 0,44 μM (2,2 μL), 0,48 μM (2,4 μL) e 0,52 μM (2,6 μL), rispettivamente.
    2. Incubare a 39 °C per tempi diversi: 10 min, 20 min, 30 min.
    3. Pulire i prodotti RPA utilizzando un kit di purificazione del DNA ed eseguire l'elettroforesi su un gel di agarosio all'1% a 120 V per 10 minuti per identificare la concentrazione ottimale del primer e i tempi di incubazione analizzando le caratteristiche delle bande.
  6. Visualizzazione del saggio RPA-CRISPR/Cas12a
    1. Aggiungere 5 μl del prodotto RPA nella soluzione B e mescolare accuratamente fino a ottenere un composto omogeneo.
    2. Posizionare i campioni nello strumento di PCR quantitativa a fluorescenza, impostare il canale FAM e leggere i valori ogni minuto per 60 minuti a 37 °C, 60x per un totale di 60 min.
      NOTA: Il segnale di fluorescenza verde può durare diversi giorni. Per assicurarsi che il sistema funzioni in modo efficace, è meglio eseguire un test privo di DNA e RNasi.

2. Valutazione della specificità della piattaforma di rivelazione basata su RPA-CRISPR/Cas12a

NOTA: Per testare la specificità di A. baumannii-DETECTR, gli acidi nucleici di A. baumannii, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Rickettsia mooseri, Enterobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Chlamydia psittaci, Legionella, Cockerella burnetii, Serratia e campioni umani sono stati sottoposti al test DETECTR.

  1. Utilizzare modelli di DNA ottenuti da varie specie utilizzando il kit DNA di riferimento o isolandoli facendo bollire i batteri nell'acqua. Assicurarsi che tutti i modelli abbiano la stessa concentrazione. Usa l'acqua come controllo negativo.
  2. Aggiungere 10 ng o 1 μL di maschere di DNA alla soluzione A contenente primer F3R3. Aggiungere 2,5 μl di MgOAc, mescolare accuratamente e incubare la miscela a 39 °C per 20 minuti.
  3. Dopo 20 minuti, aggiungere 5 μl del prodotto del passaggio precedente alla soluzione B e mescolare.
  4. Inserire lo strumento di PCR quantitativa a fluorescenza, impostare il canale su FAM e leggere il valore una volta al minuto a 37 °C, per un totale di 60 x per 60 min.

3. Valutazione della sensibilità della piattaforma di rilevamento basata su RPA-CRISPR/Cas12a

  1. Utilizzare un plasmide ricombinante positivo, che è stato preparato a una concentrazione di 1-107 copie/μL, come modello per la reazione. Utilizzare acqua per il controllo negativo.
  2. Eseguire il metodo seguendo i passaggi 2.2-2.4.
    NOTA: Il set di primer RPA-F3 e RPA-R3 è progettato per amplificare un frammento più breve di 174 coppie di basi dal plasmide ricombinante positivo.

4. Preparazioni mentre il campione è esposto alla luce UV e rilevamento LFS

  1. Estrarre il numero richiesto di strisce reattive ed etichettarle in modo appropriato.
  2. Trasferire 10 μl di prodotti amplificati dalle fasi 2 e 3 in provette PCR separate, rispettivamente. Quindi, aggiungere 40 μl di ddH2O a ciascuna provetta.
    NOTA: Se si utilizza un sistema di reazione auto-preparato, si consiglia di esplorare il rapporto di diluizione ottimale.
  3. Eseguire il test.
    1. Sottoporre la provetta PCR contenente i prodotti amplificati a un transilluminatore per valutare la presenza di fluorescenza.
    2. Inserire le strisce reattive nelle provette per PCR con l'estremità del tampone del campione rivolta verso il basso.
    3. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 5-10 minuti per leggere il risultato. Trascorso questo tempo, assicurarsi che il livello del liquido non superi la linea massima prima di procedere oltre.
    4. Interpreta i risultati come negativi se la linea T non mostra il colore. Interpretare i risultati come positivi se la linea T è visibile ad occhio nudo, indicando che la sonda dell'acido nucleico è stata tagliata dall'enzima Cas e l'enzima Cas è stato attivato. Considerare il risultato non valido se né la linea C né la linea T mostrano colore.

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Risultati

In questo studio, presentiamo una nuova piattaforma diagnostica portatile denominata A. baumannii-DETECTR, che integra l'efficienza di amplificazione isotermica di RPA e il sistema CRISPR-Cas12a per l'identificazione rapida e affidabile sul campo di A. baumannii. Lo schema del test DETECTR è illustrato nella Figura 1.

Dodici coppie di primer sono ...

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Discussione

I metodi diagnostici tradizionali per le infezioni da A. baumannii hanno varie restrizioni che li rendono meno accessibili e fattibili per i test point-of-care27. Ad esempio, la PCR ha una buona sensibilità e specificità, ma richiede apparecchiature specializzate per i cicli termici e flussi di lavoro complessi che devono essere eseguiti da professionisti. Il nuovo metodo qui presentato, che accoppia l'editing del genoma RPA e CRISPR-LbaCas12a con la ri...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dal progetto del piano di sviluppo scientifico e tecnologico della provincia di Jilin, Cina (20240305027YY) e dal Dipartimento delle finanze della provincia di Jilin (JLSWSRCZX2023-55, JLSWSRCZX2021-041).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
 -20 °C FreezerHaierHYCD-290China
Agarose BasicBioFroxx1110GR100China
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by companywww.comatebio.com
Cas12a cutting substrate - ssDNA - fluorescent typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BHQChina
Cas12a cutting substrate - ssDNA - test paper typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BIOChina
Electrophoresis apparatusBIO-RADPOWER PAC1000USA
Fluorescence quantitative PCR instrumentBIO-RADCFX ConnectUSA
Gel Imaging SystemBIO-RADGel Doc 2000USA
https://ezassay.com/rna
https://www.ezassay.com/primer  
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM)EZassay Biotech. Co. Ltd.HD-FMBOChina
LbaCas12a (Cpf1) enhanced proteinEZassay Biotech. Co. Ltd.CAS-12E-001China
LED TransilluminatorLABGICBL-20China
Magnesium acetate, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
MicrocentrifugeallshengMini-6kChina
PCR strip tubesPCR strip tubesPST-0208-FT-CChina
TGrade Dry Bath IncubatorTiangen biochemical technology OSE-DB-01China
Tianamp Bacteria DNA KitTiangen biochemical technology DP302-02China
TIANamp Bacteria DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD.DP302 China 
TransStart FastPfu DNA Polymerase TransGen Biotech. Co. Ltd.AP221 China 
TwistAmp Basic KitTwistDXTABAS03KITUK
Universal DNA Purification KitTiangen biochemical technology DP214-03China

Riferimenti

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