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要約

アシネトバクター・バウマニーの迅速かつ正確な検出を容易にするために、A. baumannii感染を特定するためのLbaCas12aエンドヌクレアーゼと組み合わせたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)を使用するプロトコルを提示します。

要約

グラム陰性菌であるアシネトバクター・バウマニーは、死亡率の高い重篤な感染症を引き起こすことで有名です。A. baumanniiの迅速かつ正確な検出は、迅速な治療、効果的な感染制御、および抗生物質耐性の抑制に不可欠です。しかし、A. baumanniiのオンサイト検出を迅速かつ容易に行うための適切な方法はありません。DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter(DETECTR)システムは、Cas12aの標的特異的認識機能とRecombinase Polymerase Amplification(RPA)の等温増幅効率を統合することにより、A. baumanniiの検出に迅速、正確、かつ高感度なアプローチを提供します。このプロトコルでは、RPAとLbaCas12aエンドヌクレアーゼを組み合わせたA.baumanniiの検出について詳しく説明します。この記事では、DNAの抽出、特定のDNA配列の選択、プライマーおよびCRISPR RNA(crRNA)の設計、ポジティブ組換えプラスミドの構築、Cas12a-RPAアッセイのセットアップ、RPA増幅システムの最適化、リアルタイムPCR装置などの蛍光検出ツールを使用したRPA-CRISPR/Cas12aアッセイの可視化、 感度と特異性の評価。

概要

臨床微生物学では、アシネトバクター・バウマニー感染の検出は大きな課題です。このグラム陰性菌は、特に免疫不全の患者において、死亡率が高い場合でも、重篤な臨床症状を伴う感染症を引き起こす可能性があります1。従来の培養ベースの病原体感染検出法は時間がかかり、感度に欠ける可能性があるため、抗生物質治療が遅れ、患者の転帰が損なわれる可能性があります。A. baumanniiの迅速かつ正確な同定は、効果的な治療とアウトブレイク制御に不可欠です。このニーズを満たすために、核酸増幅を用いた分子技術が研究されてきました。ただし、これらのアプローチには高度なサーマルサイクリング機器が必要になることが多く、十分な訓練を受けた技術者や定評のある研究所では制限される場合があります。これらの課題を克服するために、研究は等温増幅法の開発にますます焦点を当てています2,3,4。

リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)は、Piepenburgら 5 によって確立された方法であり、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と同様にDNAを増幅するために使用されますが、温度サイクルは必要ありません。この分析法には、50 mM Tris(pH 7.5)、100 mM 酢酸カリウム、14 mM 酢酸マグネシウム、2 mM DTT、5% T PEG20000(高分子量ポリエチレングリコール)、200 μM dNTP、3 mM ATP、50 mM ホスホクレアチン、100 μg/mL クレアチンキナーゼ、120 μg/mL UvsX、30 μg/mL UvsY、900 μg/mL Gp32、30 μg/mL Bsu LF、 450 nM プライマー、および DNA テンプレート。増幅プロセスは、3 mM ATPおよび5% PEG20000の存在下でリコンビナーゼタンパク質UvsXがプライマーに結合し、リコンビナーゼ-プライマー複合体を形成することから始まります。次に、この複合体は、プライマーと二本鎖DNA上の相同配列との組み合わせを促進します。

UvsYの助けを借りて、リコンビナーゼUvsXはプライマーとテンプレート鎖との間の交換を促進し、標的DNAの1本鎖の置換をもたらします。Gp32は、一本鎖DNA構造の維持に役立ちます。最後に、組換え酵素が解離し、DNA鎖を置換できるDNAポリメラーゼ(Bsu LF)がプライマーの3'末端に結合し、デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)の存在下でプライマーを伸長します。このプロセスは周期的に繰り返され、指数関数的な増幅を達成します。すべての増幅プロセスは、20〜40分以内に、37°C〜42°Cの比較的一定の温度で完了できます。 この温度範囲は生理学的温度とほぼ同じであるため、RPAは最小限の環境で実施できるため、RPAはDNAの検出と分析のための汎用性と効率的なツールとなっています。

クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復配列(CRISPR)およびCRISPR関連タンパク質(CRISPR-Cas)システムは、クラスIおよびクラスIIのシステムを包含する細菌および古細菌の適応免疫メカニズムとして機能します。クラスIIには、Cas12(a、b、f)、Cas13(a、b)、およびCas14などのタンパク質が含まれ、これらはCRISPR RNA(crRNA)6,7,8によって誘導される標的DNAまたはRNAを同定し、切断する。LbaCas12a(またはCpf1)は、crRNA誘導DNAエンドヌクレアーゼです。crRNAは、CRISPR-Casシステム内のガイドRNAとして機能し、Casタンパク質と複合体を形成します。スペーサー領域を活用して標的DNAとペアになり、タンパク質複合体を標的配列に効果的に誘導します。配列5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3'は、すべてのLbaCas12a crRNAの定数要素である保存されたcrRNAリピートとして機能します。このリピートの後には、目的のDNAターゲットによって異なるターゲット特異的なセグメントがあります。このターゲティング配列の長さは18〜24ヌクレオチドの範囲です。

PAM(Protospacer-Adjacent Motif)配列(TTTV、VはA、C、またはG)は、DNAターゲットの非相補鎖の5'末端に位置しています。Cas12aは、PAM配列で標的の二本鎖DNAを切断します。続いて、活性化されたCasタンパク質は、一本鎖DNA(ssDNA)の非特異的なトランス切断を実行する9,10,11,12。したがって、フルオロフォアおよびクエンチャーで標識されたssDNAは切断を受け、その結果、側副切断8,13に続く蛍光シグナルが放出される。蛍光強度は、正確な核酸検出のために蛍光リーダーを使用して定量化できます14。特に、Cas12aはDNA解析に広く利用されており、その結合と標的配列の切断はProtospacer-Adjacent Motif(PAM)の認識を条件としていますが、Cas13aはそのような要件とは無関係に動作します。

CRISPR-Casシステム15,16,17は、単一の反応18,19,20,21内での切断を容易にする。上記2つを組み合わせることにより、核酸検出のためのA.baumannii-DECER(LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii)として知られる堅牢なツールを作成することができます22,23,24。このプロトコルは、Cas12aのDNase活性とRPAを組み合わせて使用し、A. baumanniiの16s rDNA遺伝子内のcrRNA誘導配列を特異的に標的化して切断し、それにより病原体の高感度かつ正確な検出を可能にすることを示しています。

A. baumannii-DETECTR法は、従来の検出法25,26に比べていくつかの利点を提示する。まず、RPAの等温特性は、サーマルサイクラーに依存しない増幅メカニズム5を通じて、運用手順を合理化し、コストを削減します。次に、Cas12aエンドヌクレアーゼは、crRNAを介したターゲティングとWatson-Crick塩基対化7により、アッセイの特異性を高めます。最後に、A. baumannii-DETECTRのワンチューブ法を使用すると、時間を節約するだけでなく、アンプリコン汚染のリスクを大幅に減らすことができます19。

このプロトコルは、DNA抽出の抽出、標的DNA配列の選択、プライマーおよびcrRNAの設計、陽性組換えプラスミドの構築、Cas12a-RPAアッセイのセットアップの確立、RPA増幅の最適化の最適化、およびリアルタイムPCRマシンなどの蛍光検出機器ツールを使用して結果を視覚化するための手順を概説しています。 感度と特異性の評価を完備しています。

A. baumannii-DETECTR法は、タイムリーで効果的な治療、堅牢な感染制御、および抗生物質耐性の蔓延の抑制を促進することにより、患者の転帰を向上させる上で有望です。このプロトコルは、Cas12a-RPA技術の実装に関する包括的なガイドラインとして機能し、さまざまな医療現場での有用性を高めることができます。ただし、一貫性と信頼性のある結果を得るためには、特定のラボ条件とサンプルの種類に基づいてすべてのステップを最適化する必要があることに注意することが重要です。

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プロトコル

1. A. baumannii -DETECTRの作製

注: A. baumannii-DETECTRの構築は、プライマーとcrRNAの設計、ポジティブ組換えプラスミドの構築、反応溶液の調製、RPAによる等温DNA増幅、およびRPA-CRISPR/Cas12aアッセイの可視化を含む4段階のプロセスです。DETECTRアッセイの概略図を 図1に示します。

  1. プライマーとcrRNAの設計( 補足ファイル1を参照)
    1. プライマーの設計原則に基づいて、設計ツールを使用して12ペアのプライマーを設計します。4つのフォワードプライマー(F0-F3)と3つのリバースプライマー(R1-R3)を入手して、12組のプライマー(F0R1、F0R2、F0R3、F1R1、F1R2、F1R3、F2R1、F2R2、F2R3、F3R1、F3R2、F3R3)を構成します。
      1. プライマーの5'末端に、連続的なGストレッチではなく、最初の3-5ヌクレオチド内にCまたはT塩基が含まれていることを確認してください。さらに、増幅を強化するために、3'末端の最後の3つのヌクレオチドが理想的にはGおよびC塩基であることを確認してください。
      2. ヘアピン形成を避けるために自己相補配列を持たず、それらの間に4つ以下の相補的または相同的な塩基を持つプライマーを設計します。プライマーの二量体化を避けるために、3'末端の相補性を避けてください。
    2. National Center for Biotechnology Information(NCBI)のPrimer-BLASTツールを使用して、各プライマーペアの特異性を評価し、プライマーの有効性と特異性を評価します。
      注:Primer-BLASTは、NCBIデータベースを利用して、設計されたプライマーに一致する配列を見つけることができ、ユーザーがプライマーの有効性と特異性を評価するのに役立ちます。
    3. プライマースクリーニングに続いて、LbaCas12a crRNAスキャフォールド配列(5'-UAAUUCUACUAAGUGUAGAU-3')を固定配列として使用して、CRISPR RNA(crRNA)またはガイドRNA(gRNA)を設計します。ターゲット特異的なセグメント(5'-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3')を組み込み、PAMモチーフが非相補鎖の5'末端に位置するようにします。
      注:すべてのオリゴヌクレオチドおよびcrRNAの配列を 表1に示します。
  2. ポジティブ組換えプラスミドの構造
    1. プライマーセット A. baumannii 16s rDNA-F (フォワードプライマー) と A. baumannii 16s rDNA-R (リバースプライマー) を使用して、16s rDNA セグメントを増幅します。
      1. 10 μM F および 10 μM R 1 μL を 1 μL 、5x FastpFu バッファー 10 μL を、FastpFu ポリメラーゼ 1 μL を、2.5 mM dNTP を 4 μL 、10 ng/μL A. baumannii ゲノム DNA 1 μL を 1 μL の 50 μL PCR システムに加えます。
      2. PCRサイクル条件を次のように設定します:最初の変性を95°Cで5分間行い、その後、95°Cで30秒間33サイクルの変性、55°Cで30秒間アニーリング、72°Cで1分間20秒間の伸展を行います。最後に、72°Cで10分間行い、最終的な延長を行います。
    2. 陽性のPCR産物を精製するには、製造元の指示に従ってDNA精製キットを使用してください。その後、精製したDNAをBamHIおよびSalI酵素で消化したpUC57ベクターにクローニングします。
      注:このプロセスにより、保存された領域を含む陽性の組換えプラスミドが作成されます。
    3. 滅菌したddH2Oで陽性組換えプラスミドを10倍刻みで連続希釈し、1コピー/μLから107 コピー/μL の濃度を達成します。希釈したプラスミドは、その後の実験のために-20°Cで保存してください。
  3. 溶液調製
    1. 溶液Aを以下のように調製します:各反応について、29.5 μLのPrimer Free Rehydration buffer、2.4 μLの10 μM A. baumannii-Fおよび10 μM A. baumannii-R、および12.2μLのddH2Oを添加して、最終容量46.5 μLを達成します。次に、RPA Kitの酵素反応チューブに反応混合物を加えます。ピペットで混ぜます。
      注:A.バウマニー-FおよびRのプライマーは、 A.バウマニー 遺伝子を標的とするアッセイで使用されます。配列については 、表1 を参照してください。
    2. 溶液Bを以下のように調製します:各反応ごとに、0.24 μLの10 μM ssDNAレポーター、2 μLの10x Cas12a Reaction Buffer、1 μL 1 μM crRNA1 μL、1 μM Cas12aの1 μL、および10.76μLのddH2Oを添加して、最終容量15 μLを達成します。
      注:プローブ(ssDNAレポーター)は購入され、5'末端に5-カルボキシフルオレセイン(FAM)蛍光色素、3'末端にBlack Hole Quencher 1(BHQ1)クエンチャーがタグ付けされた一本鎖DNAレポーターで構成されていました。検出が必要なサンプルが多数ある場合は、溶液Bを大量に調製し、後でサンプルをアリコートに分割します。
  4. 等温DNA増幅法(RPA)
    1. 107 コピー/μLのポジティブ組換えプラスミド1 μLを、異なるプライマーペアの溶液Aに添加します。よく混ぜます。次に、2.5 μLの280 mM酢酸マグネシウム(MgOAc)を溶液に加え、よく混合します。
      注:RPA反応は、MgOAcが添加されるとすぐに開始されます。
    2. 39°Cで20分間インキュベートします。20分後、RPAと精製キットを使用して異なるプライマーで増幅した生成物を精製し、クリーンアンプリコンを120 Vの120 Vで10分間実行して、最も明るく、最も広いバンドを最適なプライマーペアとして選択します。
      注:テンプレートのコピー数が少ない場合は、4分後にEPチューブ、ボルテックスを取り外し、短時間回転させます。次に、加熱装置でさらに16分間交換します。増幅後、作業面がアンプリコンで汚染されないように、チューブを細心の注意を払って開く必要があります。この予防措置により、その後の実験手順で偽陽性結果を誘発するリスクが軽減されます。
  5. RPA増幅システムの最適化
    注:前のステップで選択した最適なプライマーペアF3R3は、最適なプライマー濃度と時間をスクリーニングするために、RPA増幅反応の異なる最終濃度に設定されました。NCは、対応するプライマー濃度のブランクコントロールです。
    1. RNase-free ddH 2 Oの体積を10 μM F3および10 μM R3の最終プライマー濃度を達成するために、溶液A中の46.5 μLを一定に保ち、0.40 μM(2.0 μL)、0.44 μM(2.2 μL)、0.48 μM(2.4 μL)、および0.52 μM(2.6 μL)で10 μM F3および10 μM R3の最終プライマー濃度を達成するために、RNaseフリーddH2Oの容量を適宜調整します。 それぞれ。
    2. 39°Cでインキュベートする時間:10分、20分、30分。
    3. DNA精製キットを使用してRPA製品を洗浄し、1%アガロースゲルで120 Vで10分間電気泳動を行い、バンドの特性を分析することにより、最適なプライマー濃度とインキュベーション時間を特定します。
  6. RPA-CRISPR/Cas12aアッセイの可視化
    1. 5 μLのRPA製品を溶液Bに加え、均一になるまで十分に混合します。
    2. サンプルを蛍光定量PCR装置にセットし、FAMチャンネルを設定し、37°C、60倍、合計60分間、毎分値を読み取ります。
      注:緑色の蛍光シグナルは数日間持続することがあります。システムが効果的に機能することを確認するには、DNAおよびRNaseフリーテストを実行することをお勧めします。

2. RPA-CRISPR/Cas12aを用いた検出プラットフォームの特異性評価

注: A. baumannii-DETECTRの特異性をテストするために、 A. baumannii、 Streptococcus pneumoniae、 黄色ブドウ球菌、 Rickettsia mooseri、 Enterobacter、 Escherichia coli、 Pseudomonas aeruginosa、 Klebsiella、 Chlamydia psittaci、 Legionella、 Cockerella burnetii、 Serratia、およびヒトサンプルの核酸をDETECTRテストに供しました。

  1. 参照されているDNAキットを使用してさまざまな種から得られたDNAテンプレートを使用するか、水中でバクテリアを沸騰させて単離します。すべてのテンプレートの濃度が等しいことを確認します。ネガティブコントロールとして水を使用します。
  2. 10 ngまたは1 μLのDNAテンプレートを、F3R3プライマーを含む溶液Aに添加します。2.5 μLのMgOAcを加えて十分に混合し、39°Cで20分間インキュベートします。
  3. 20分後、前のステップで得られた製品5 μLを溶液Bに加えて混合します。
  4. 蛍光定量PCR装置にセットし、チャンネルをFAMに設定し、37°Cで1分に1回、合計60回60分間値を読み取ります。

3. RPA-CRISPR/Cas12aを用いた検出プラットフォームの感度評価

  1. 1-107コピー/μLの濃度で調製されたポジティブ組換えプラスミドを反応のテンプレートとして使用します。ネガティブコントロールには水を使用してください。
  2. 手順2.2〜2.4に従って方法を実行します。
    注:プライマーセットRPA-F3およびRPA-R3は、ポジティブ組換えプラスミドからの174塩基対の短いフラグメントを増幅するように設計されています。

4. サンプルがUV光およびLFS検出下にある状態での調製

  1. 必要な数のテストストリップを取り出し、適切にラベルを付けます。
  2. ステップ2およびステップ3で増幅した生成物10 μLをそれぞれ別々のPCRチューブに移します。次に、各チューブに40 μLのddH2Oを加えます。
    注:自己調製反応システムを使用する場合は、最適な希釈比を検討することをお勧めします。
  3. テストを実行します。
    1. 増幅された生成物を含むPCRチューブをトランスイルミネーターにさらして、蛍光の存在を評価します。
    2. サンプルパッドの端を下に向けて、テストストリップをPCRチューブに挿入します。
    3. 室温で5〜10分間放置して、結果を読みます。この時間が経過した後、液面が最大ラインを超えないようにしてから、先に進みます。
    4. T 行に色が表示されていない場合は、結果を負と解釈します。Tラインが肉眼で見える場合、つまり核酸プローブがCas酵素によって切断され、Cas酵素が活性化されたことを示している場合は、結果を陽性と解釈します。C ラインと T ラインのどちらも色が表示されていない場合、結果は無効であると考えてください。

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結果

本研究では、RPAの等温増幅効率とCRISPR-Cas12aシステムを統合し、A. baumanniiの迅速かつ信頼性の高いフィールド同定を実現する、新しいポータブル診断プラットフォームであるA. baumannii-DETECTRを紹介します。DETECTRアッセイの概略図を図1に示します。

12組のプライマ...

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ディスカッション

A. baumannii感染症の従来の診断方法には、さまざまな制限があり、ポイントオブケア検査へのアクセスや実現可能性が低くなっています27。例えば、PCRは感度と特異性に優れていますが、特殊なサーマルサイクリング装置や複雑なワークフローが必要で、専門家が操作する必要があります。ここで紹介する新しい方法は、RPAとCRISPR-LbaCas12aゲノム...

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開示事項

著者は、競合する利益がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、中国吉林省科学技術発展計画プロジェクト(20240305027YY)および吉林省財政局(JLSWSRCZX2023-55、JLSWSRCZX2021-041)の支援を受けて行われました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
 -20 °C FreezerHaierHYCD-290China
Agarose BasicBioFroxx1110GR100China
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by companywww.comatebio.com
Cas12a cutting substrate - ssDNA - fluorescent typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BHQChina
Cas12a cutting substrate - ssDNA - test paper typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BIOChina
Electrophoresis apparatusBIO-RADPOWER PAC1000USA
Fluorescence quantitative PCR instrumentBIO-RADCFX ConnectUSA
Gel Imaging SystemBIO-RADGel Doc 2000USA
https://ezassay.com/rna
https://www.ezassay.com/primer  
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM)EZassay Biotech. Co. Ltd.HD-FMBOChina
LbaCas12a (Cpf1) enhanced proteinEZassay Biotech. Co. Ltd.CAS-12E-001China
LED TransilluminatorLABGICBL-20China
Magnesium acetate, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
MicrocentrifugeallshengMini-6kChina
PCR strip tubesPCR strip tubesPST-0208-FT-CChina
TGrade Dry Bath IncubatorTiangen biochemical technology OSE-DB-01China
Tianamp Bacteria DNA KitTiangen biochemical technology DP302-02China
TIANamp Bacteria DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD.DP302 China 
TransStart FastPfu DNA Polymerase TransGen Biotech. Co. Ltd.AP221 China 
TwistAmp Basic KitTwistDXTABAS03KITUK
Universal DNA Purification KitTiangen biochemical technology DP214-03China

参考文献

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