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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Pour faciliter la détection rapide et précise d’Acinetobacter baumannii, nous présentons un protocole qui utilise l’amplification par polymérase recombinase (RPA) en conjonction avec l’endonucléase LbaCas12a pour identifier les infections à A. baumannii .

Résumé

Acinetobacter baumannii, une bactérie à Gram négatif, est connue pour provoquer des infections graves avec des taux de mortalité élevés. La détection rapide et précise d’A. baumannii est cruciale pour un traitement rapide, un contrôle efficace des infections et la réduction de la résistance aux antibiotiques. Cependant, il n’existe pas de méthode appropriée pour une détection rapide et facile sur place d’A. baumannii. Le système DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) offre une approche rapide, précise et sensible de la détection d’A. baumannii en intégrant les capacités de reconnaissance spécifique à la cible de Cas12a avec l’efficacité d’amplification isotherme de la recombinase et de l’amplification polymérase (RPA). Ce protocole détaille la détection d’A. baumannii à l’aide de la RPA associée à l’endonucléase LbaCas12a. Les étapes suivantes sont décrites dans cet article : extraction de l’ADN, sélection d’une séquence d’ADN spécifique, conception de l’amorce et de l’ARN CRISPR (ARNcr), construction du plasmide recombinant positif, mise en place du test Cas12a-RPA, optimisation du système d’amplification RPA, visualisation du test RPA-CRISPR/Cas12a à l’aide d’un outil de détection de fluorescence tel qu’un instrument de PCR en temps réel, et l’évaluation de la sensibilité et de la spécificité.

Introduction

En microbiologie clinique, la détection des infections à Acinetobacter baumannii représente un défi de taille. Cette bactérie à Gram négatif peut provoquer des infections avec des symptômes cliniques graves, même avec des taux de mortalité élevés, en particulier chez les patients immunodéprimés1. Les méthodes traditionnelles de détection des infections pathogènes basées sur la culture prennent du temps et peuvent manquer de sensibilité, ce qui peut retarder le traitement antibiotique et compromettre les résultats pour les patients. L’identification rapide et précise d’A. baumannii est cruciale pour un traitement efficace et le contrôle des épidémies. Des techniques moléculaires utilisant l’amplification des acides nucléiques ont été explorées pour répondre à ce besoin. Cependant, ces approches nécessitent souvent des équipements de cyclage thermique sophistiqués et peuvent être limitées par des techniciens bien formés et des laboratoires bien établis. Pour surmonter ces défis, la recherche se concentre de plus en plus sur le développement de méthodes d’amplification isotherme 2,3,4.

L’amplification par polymérase recombinase (RPA) est une méthode établie par Piepenburg et al 5 et utilisée pour amplifier l’ADN, similaire à la réaction en chaîne par polymérase (PCR) mais sans avoir besoin de cycle de température. Cette méthode comprend 50 mM de Tris (pH 7,5), 100 mM d’acétate de potassium, 14 mM d’acétate de magnésium, 2 mM de DTT, 5 % de PEG20000 (un polyéthylène glycol de haut poids moléculaire), 200 μM de dNTPs, 3 mM d’ATP, 50 mM de phosphocréatine, 100 μg/mL de créatine kinase, 120 μg/mL d’UvsX, 30 μg/mL d’UvsY, 900 μg/mL de Gp32, 30 μg/mL de Bsu LF, Amorces 450 nM et matrices d’ADN. Le processus d’amplification commence par la liaison de la protéine recombinase UvsX aux amorces en présence de 3 mM d’ATP et de 5 % de PEG20000 formant un complexe recombinase-amorce. Ce complexe facilite ensuite la combinaison des amorces avec les séquences homologues sur l’ADN double brin.

Avec l’aide d’UvsY, la recombinase UvsX facilite l’échange entre l’amorce et le brin matrice, ce qui entraîne le déplacement d’un brin de l’ADN cible. Gp32 aide à maintenir la structure de l’ADN simple brin. Enfin, la recombinase se dissocie, et une ADN polymérase (Bsu LF) capable de déplacer les brins d’ADN se lie à l’extrémité 3' de l’amorce, l’allongeant en présence de désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP). Ce processus est répété de manière cyclique, ce qui permet d’obtenir une amplification exponentielle. Tous les processus d’amplification peuvent être terminés en 20 à 40 minutes et à des températures relativement constantes entre 37 °C et 42 °C. Cette plage de température est à peu près identique aux températures physiologiques, ce qui permet d’effectuer l’APR dans un environnement minimaliste, ce qui fait de l’APR un outil polyvalent et efficace pour la détection et l’analyse de l’ADN.

Le système CRISPR (CRISPR-Cas) et le système CRISPR-Cases (CRISPR-Cas) fonctionnent comme un mécanisme immunitaire adaptatif chez les bactéries et les archées, englobant les systèmes de classe I et de classe II. La classe II comprend des protéines telles que Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) et Cas14, qui identifient et clivent l’ADN ou l’ARN cible guidé par l’ARN CRISPR (ARNcr)6,7,8 . LbaCas12a (ou Cpf1) est une endonucléase d’ADN guidée par l’ARNcr. L’ARNcr sert d’ARN guide dans le système CRISPR-Cas, où il se complexe avec les protéines Cas. Il exploite sa région d’espacement pour s’apparier à l’ADN cible, dirigeant efficacement le complexe protéique vers les séquences cibles. La séquence 5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3' sert de répétition conservée de l’ARNcr, un élément constant dans tous les ARNcr LbaCas12a. À la suite de cette répétition se trouve un segment spécifique à la cible qui diffère en fonction de la cible d’ADN prévue. Cette séquence de ciblage varie de 18 à 24 nucléotides de longueur.

La séquence PAM (Protospacer-Adjacent Motif) (TTTV, où V peut être A, C ou G) est située à l’extrémité 5' du brin non complémentaire de la cible d’ADN. Le Cas12a coupe l’ADN double brin cible au niveau de la séquence PAM. Par la suite, les protéines Cas activées exécutent un trans-clivage non spécifique de l’ADN simple brin (ADNsb)9,10,11,12. Ainsi, l’ADNsb marqué avec un fluorophore et un quencher subit un clivage, entraînant l’émission d’un signal fluorescent suite au clivage collatéral 8,13. L’intensité de la fluorescence peut être quantifiée à l’aide d’un lecteur de fluorescence pour une détection précise des acides nucléiques14. Notamment, Cas12a est largement utilisé pour l’analyse de l’ADN, sa liaison et son clivage de séquences cibles subordonnant la reconnaissance du motif adjacent au protospacer (PAM), tandis que Cas13a fonctionne indépendamment d’une telle exigence.

Les systèmes CRISPR-Cas 15,16,17 facilitent le clivage au sein d’une seule réaction 18,19,20,21. La combinaison des deux ci-dessus peut créer un outil robuste connu sous le nom de A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) pour la détection des acides nucléiques 22,23,24. Ce protocole démontre l’utilisation de la RPA en conjonction avec l’activité de la DNase de Cas12a pour cibler et cliver spécifiquement une séquence guidée par l’ARNcr dans le gène de l’ADNr 16s d’A. baumannii, permettant ainsi une détection sensible et précise de l’agent pathogène.

La méthode A. baumannii-DETECTR présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes de détection conventionnelles25,26. Tout d’abord, la caractéristique isotherme de la RPA rationalise les procédures opérationnelles et réduit les coûts grâce à son mécanisme d’amplification indépendant du thermocycleur5. Deuxièmement, l’endonucléase Cas12a augmente la spécificité du test au moyen d’un ciblage médié par l’ARNcr et d’un appariement de bases Watson-Crick7. Enfin, l’utilisation de la méthode monotube d’A. baumannii-DETECTR permet non seulement de gagner du temps, mais aussi de réduire considérablement le risque de contamination par des amplicons19.

Le protocole décrit les étapes de l’extraction de l’ADN, de la sélection des séquences d’ADN cibles, de la conception des amorces et des ARNcr, de la construction de plasmides recombinants positifs, de la mise en place du test Cas12a-RPA, de l’optimisation de l’amplification de la RPA et de la visualisation des résultats à l’aide d’instruments de détection de fluorescence tels qu’une machine de PCR en temps réel. complet avec des évaluations de sensibilité et de spécificité.

La méthode A . baumannii-DETECTR est prometteuse pour améliorer les résultats des patients en facilitant un traitement rapide et efficace, un contrôle robuste des infections et l’endiguement de la propagation de la résistance aux antibiotiques. Ce protocole peut servir de ligne directrice complète pour la mise en œuvre de la technologie Cas12a-RPA, améliorant ainsi son utilité dans divers contextes de soins de santé. Cependant, il est crucial de noter que chaque étape doit être optimisée en fonction des conditions spécifiques du laboratoire et de la variété des échantillons pour garantir des résultats cohérents et fiables.

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Protocole

1. Construction de l’A. baumannii -DETECTR

REMARQUE : La construction d’A. baumannii-DETECTR est un processus en quatre étapes impliquant la conception de l’amorce et de l’ARNcr, la construction d’un plasmide recombinant positif, la préparation de solutions réactionnelles, l’amplification isotherme de l’ADN par RPA et la visualisation du test RPA-CRISPR/Cas12a. Le schéma du test DETECTR est illustré à la figure 1.

  1. Conception de l’amorce et de l’ARNcr (voir Fichier supplémentaire 1)
    1. Concevez 12 paires d’apprêts à l’aide d’outils de conception sur la base des principes de conception des apprêts. Obtenez quatre amorces directes (F0-F3) et trois amorces inverses (R1-R3) pour composer douze paires d’amorces (F0R1, F0R2, F0R3, F1R1, F1R2, F1R3, F2R1, F2R2, F2R3, F3R1, F3R2, F3R3).
      1. Assurez-vous que l’extrémité 5' de l’amorce contient des bases C ou T dans les 3 à 5 premiers nucléotides au lieu d’un étirement G continu. De plus, assurez-vous que les trois derniers nucléotides à l’extrémité 3' sont idéalement des bases G et C pour améliorer l’amplification.
      2. Concevez des amorces sans séquences auto-complémentaires pour éviter la formation d’épingles à cheveux et avec pas plus de quatre bases complémentaires ou homologues entre elles. Évitez la complémentarité de l’extrémité 3' pour éviter la dimérisation de l’amorce.
    2. Évaluez la spécificité de chaque paire d’amorces à l’aide de l’outil Primer-BLAST du National Center for Biotechnology Information (NCBI) pour évaluer l’efficacité et la spécificité des amorces.
      REMARQUE : Primer-BLAST peut utiliser la base de données NCBI pour trouver des séquences qui correspondent aux amorces conçues, aidant ainsi les utilisateurs à évaluer l’efficacité et la spécificité des amorces.
    3. Après le criblage de l’amorce, concevez l’ARN CRISPR (ARNcr) ou l’ARN guide (ARNg) en utilisant la séquence d’échafaudage de l’ARNcr LbaCas12a (5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3') comme séquence fixe. Incorporer un segment spécifique à la cible (5'-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3'), en veillant à ce que le motif PAM soit situé à l’extrémité 5' du brin non complémentaire.
      REMARQUE : Les séquences de tous les oligonucléotides et de l’ARNcr sont présentées dans le tableau 1.
  2. Construction plasmidique recombinante positive
    1. Amplifiez le segment d’ADNr 16s à l’aide de l’ensemble d’amorces A. baumannii 16s rDNA-F (amorce directe) et A . baumannii 16s rDNA-R (amorce inverse).
      1. Ajoutez 1 μL de 10 μM F et 10 μM R, 10 μL de tampon pFu 5x, 1 μL de polymérase pFu rapide, 4 μL de dNTP de 2,5 mM, 1 μL d’ADN génomique d’A. baumannii de 10 ng/μL et 32 μL d’eau sans nucléases au système PCR de 50 μL.
      2. Réglez les conditions de cycle de PCR comme suit : dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 min, suivie de 33 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, de recuit à 55 °C pendant 30 s et d’extension à 72 °C pendant 1 min et 20 s. Enfin, effectuez 10 min à 72°C pour l’extension finale.
    2. Pour purifier le produit PCR positif, utilisez un kit de purification d’ADN selon les instructions du fabricant. Par la suite, clonez l’ADN purifié dans le vecteur pUC57, qui a été digéré avec les enzymes BamHI et SalI.
      REMARQUE : Ce processus aboutira à la création d’un plasmide recombinant positif contenant une région conservée.
    3. Diluez le plasmide recombinant positif en série par dizaines avec du ddH2O stérilisé pour obtenir une concentration d’une copie/μL à 10,7 copies/μL. Conservez le plasmide dilué à -20 °C pour les expériences ultérieures.
  3. Préparation de la solution
    1. Préparez la solution A comme suit : pour chaque réaction, ajoutez 29,5 μL de tampon de réhydratation sans amorce, 2,4 μL de 10 μM A. baumannii-F et 10 μM A . baumannii-R, et 12,2μL de ddH2O pour obtenir un volume final de 46,5 μL. Vortex et essorez brièvement. Ensuite, ajoutez le mélange réactionnel dans les tubes de réaction enzymatique du kit RPA. Pipette pour mélanger.
      REMARQUE : Les amorces d’A. baumannii-F et R sont utilisées dans l’essai qui cible le gène d’A. baumannii . Veuillez vous référer au tableau 1 pour la séquence.
    2. Préparez la solution B comme suit : pour chaque réaction, ajoutez 0,24 μL de 10 μM de rapporteur d’ADNsb, 2 μL de tampon de réaction 10x Cas12a, 1 μL d’ARNcr 1 μM, 1 μL de 1 μM Cas12a et 10,76μL de ddH2O pour obtenir un volume final de 15 μL.
      REMARQUE : Les sondes (rapporteur d’ADNsb) ont été achetées et se composaient d’un rapporteur d’ADN simple brin marqué avec un fluorophore 5-carboxyfluorescéine (FAM) à l’extrémité 5' et un quencher de trou noir 1 (BHQ1) à l’extrémité 3'. Dans le cas de nombreux échantillons à détecter, préparer une quantité importante de solution B, puis diviser les échantillons en aliquotes plus tard.
  4. Amplification isotherme de l’ADN (RPA)
    1. Ajouter 1 μL du plasmide recombinant positif de 10à 7 copies/μL à la solution A avec différentes paires d’amorces ; Mélanger. Ensuite, ajoutez 2,5 μL d’acétate de magnésium 280 mM (MgOAc) à la solution et mélangez bien.
      REMARQUE : Les réactions RPA commencent dès que MgOAc est ajouté.
    2. Incuber à 39 °C pendant 20 min. Après 20 min, purifiez les produits amplifiés avec différentes amorces à l’aide de RPA avec un kit de purification, puis exécutez les amplicons propres sur un gel d’agarose à 1 % à 120 V pendant 10 min pour sélectionner la bande la plus brillante et la plus large comme la meilleure paire d’amorces.
      REMARQUE : Pour un faible nombre de copies de modèle, après 4 min, retirez le tube EP, le vortex et tournez brièvement ; Ensuite, replacez-le dans l’appareil de chauffage pendant encore 16 min. Après l’amplification, les tubes doivent être ouverts avec une extrême prudence pour éviter de contaminer les surfaces de travail avec des amplicons. Cette précaution réduira le risque d’induire des résultats faussement positifs lors de procédures expérimentales ultérieures.
  5. Optimisation du système d’amplification RPA
    REMARQUE : La paire d’amorces optimale F3R3 sélectionnée à l’étape précédente a été réglée sur différentes concentrations finales pour la réaction d’amplification RPA afin d’éliminer la concentration et le temps optimaux de l’amorce. NC est un contrôle à blanc pour la concentration d’amorce correspondante.
    1. Maintenir les concentrations des autres composants constantes et le volume total de 46,5 μL dans la solution A. Ajuster le volume de ddH2O sans RNase en conséquence pour obtenir les concentrations finales de l’amorce de 10 μM F3 et 10 μM R3 à 0,40 μM (2,0 μL), 0,44 μM (2,2 μL), 0,48 μM (2,4 μL) et 0,52 μM (2,6 μL), respectivement.
    2. Incuber à 39 °C pendant différents temps : 10 min, 20 min, 30 min.
    3. Nettoyez les produits RPA à l’aide d’un kit de purification de l’ADN et effectuez une électrophorèse sur un gel d’agarose à 1 % à 120 V pendant 10 min pour identifier la concentration optimale de l’amorce et les temps d’incubation en analysant les caractéristiques des bandes.
  6. Visualisation du test RPA-CRISPR/Cas12a
    1. Ajouter 5 μL de produit RPA dans la solution B et bien mélanger jusqu’à ce que l’homogénéité soit homogène.
    2. Placez les échantillons dans l’instrument de PCR quantitative en fluorescence, réglez le canal FAM et lisez les valeurs toutes les minutes pendant 60 minutes à 37 °C, 60x pour un total de 60 minutes.
      REMARQUE : Le signal de fluorescence vert peut durer plusieurs jours. Pour s’assurer que le système fonctionne efficacement, il est préférable d’effectuer un test sans ADN ni RNase.

2. Évaluation de la spécificité de la plateforme de détection basée sur RPA-CRISPR/Cas12a

REMARQUE : Pour tester la spécificité d’A. baumannii-DETECTR, les acides nucléiques d’A. baumannii, de Streptococcus pneumoniae, de Staphylococcus aureus, de Rickettsia mooseri, d’Enterobacter, d’Escherichia coli, de Pseudomonas aeruginosa, de Klebsiella, de Chlamydia psittaci, de Legionella, de Cockerella burnetii, de Serratia et d’échantillons humains ont été soumis au test DETECTR.

  1. Utilisez des modèles d’ADN obtenus à partir de diverses espèces en utilisant le kit d’ADN référencé ou en les isolant en faisant bouillir les bactéries dans l’eau. Assurez-vous que tous les modèles ont les mêmes concentrations. Utilisez l’eau comme contrôle négatif.
  2. Ajouter 10 ng ou 1 μL de matrices d’ADN à la solution A contenant des amorces F3R3. Ajouter 2,5 μL de MgOAc, bien mélanger et incuber le mélange à 39 °C pendant 20 min.
  3. Après 20 min, ajoutez 5 μL du produit de l’étape précédente à la solution B et mélangez.
  4. Placez-le dans l’instrument de PCR quantitative de fluorescence, réglez le canal sur FAM et lisez la valeur une fois par minute à 37 °C, pour un total de 60 x pendant 60 min.

3. Évaluation de la sensibilité de la plateforme de détection basée sur RPA-CRISPR/Cas12a

  1. Utilisez un plasmide recombinant positif, qui a été préparé à une concentration de 1-107 copies/μL, comme matrice de la réaction. Utilisez de l’eau pour le contrôle négatif.
  2. Effectuez la méthode en suivant les étapes 2.2 à 2.4.
    REMARQUE : Le jeu d’amorces RPA-F3 et RPA-R3 est conçu pour amplifier un fragment plus court de 174 paires de bases à partir du plasmide recombinant positif.

4. Préparations pendant que l’échantillon est sous lumière UV et détection LFS

  1. Sortez le nombre requis de bandelettes de test et étiquetez-les de manière appropriée.
  2. Transférez 10 μL des produits amplifiés des étapes 2 et 3 dans des tubes PCR séparés, respectivement. Ajoutez ensuite 40 μL de ddH2O dans chaque tube.
    REMARQUE : Si vous utilisez un système de réaction auto-préparé, il est recommandé d’explorer le taux de dilution optimal.
  3. Effectuez le test.
    1. Soumettez le tube PCR contenant les produits amplifiés à un transilluminateur pour évaluer la présence de fluorescence.
    2. Insérez les bandelettes de test dans les tubes PCR avec l’extrémité du tampon d’échantillon vers le bas.
    3. Laissez-le reposer à température ambiante pendant 5 à 10 minutes pour lire le résultat. Après ce délai, assurez-vous que le niveau de liquide ne dépasse pas la ligne maximale avant de continuer.
    4. Interprétez les résultats comme négatifs si la ligne T n’affiche pas la couleur. Interprétez les résultats comme positifs si la ligne T est visible à l’œil nu, indiquant que la sonde d’acide nucléique a été clivée par l’enzyme Cas et que l’enzyme Cas a été activée. Considérez que le résultat n’est pas valide si ni la ligne C ni la ligne T n’affichent de couleur.

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Résultats

Dans cette étude, nous présentons une nouvelle plate-forme de diagnostic portable nommée A. baumannii-DETECTR, qui intègre l’efficacité d’amplification isotherme du système RPA et CRISPR-Cas12a pour une identification rapide et fiable d’A. baumannii sur le terrain. Le schéma du test DETECTR est illustré à la figure 1.

Douze paires d?...

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Discussion

Les méthodes de diagnostic traditionnelles des infections à A. baumannii sont soumises à diverses restrictions qui les rendent moins accessibles et moins réalisables pour les tests au point de service27. Par exemple, la PCR a une bonne sensibilité et spécificité, mais nécessite un équipement de cyclage thermique spécialisé et des flux de travail complexes qui doivent être exploités par des professionnels. La nouvelle méthode présentée ici,...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le projet de plan de développement scientifique et technologique de la province de Jilin, Chine (20240305027YY) et le ministère des Finances de la province de Jilin (JLSWSRCZX2023-55, JLSWSRCZX2021-041).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
 -20 °C FreezerHaierHYCD-290China
Agarose BasicBioFroxx1110GR100China
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by companywww.comatebio.com
Cas12a cutting substrate - ssDNA - fluorescent typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BHQChina
Cas12a cutting substrate - ssDNA - test paper typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BIOChina
Electrophoresis apparatusBIO-RADPOWER PAC1000USA
Fluorescence quantitative PCR instrumentBIO-RADCFX ConnectUSA
Gel Imaging SystemBIO-RADGel Doc 2000USA
https://ezassay.com/rna
https://www.ezassay.com/primer  
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM)EZassay Biotech. Co. Ltd.HD-FMBOChina
LbaCas12a (Cpf1) enhanced proteinEZassay Biotech. Co. Ltd.CAS-12E-001China
LED TransilluminatorLABGICBL-20China
Magnesium acetate, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
MicrocentrifugeallshengMini-6kChina
PCR strip tubesPCR strip tubesPST-0208-FT-CChina
TGrade Dry Bath IncubatorTiangen biochemical technology OSE-DB-01China
Tianamp Bacteria DNA KitTiangen biochemical technology DP302-02China
TIANamp Bacteria DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD.DP302 China 
TransStart FastPfu DNA Polymerase TransGen Biotech. Co. Ltd.AP221 China 
TwistAmp Basic KitTwistDXTABAS03KITUK
Universal DNA Purification KitTiangen biochemical technology DP214-03China

Références

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