Criosección e inmunotinción de tejido del oído interno de ratón: desde la etapa embrionaria hasta la adulta

Resumen

Este protocolo, destinado a usuarios novatos de tejido del oído interno de ratón, detalla exhaustivamente los pasos para procesar los oídos internos de ratón en diferentes etapas de desarrollo para la inmunotinción de secciones.

Resumen

Este protocolo detalla los métodos histológicos generales para preparar muestras de oído interno de ratones embrionarios, neonatos y adultos. El propósito de este protocolo es proporcionar un método sencillo y estandarizado para el procesamiento del tejido del oído interno para los investigadores, posiblemente nuevos en el campo, interesados en trabajar con la cóclea del ratón. Aquí se incluyen protocolos para la disección, fijación, inclusión, criosección e inmunotinción. La inmunotinción por secciones es uno de los mejores métodos para examinar células individuales en el contexto de toda la cóclea.

Los pasos clave incluyen la disección del oído interno del cráneo, la fijación del tejido con paraformaldehído al 4%, la inclusión con el compuesto de temperatura óptima de corte, la criosección y la inmunotinción con anticuerpos dirigidos a proteínas específicas expresadas por la cóclea.

En nuestros métodos se incluyen consideraciones especiales para la cóclea dada su
forma y estructura. Se necesitan habilidades de enfoque y disección razonablemente buenas, ya que el daño tisular puede afectar la calidad de la inmunotinción y la consistencia entre las muestras. Sin embargo, con los procedimientos que describíamos, la mayoría de los usuarios pueden ser entrenados en unas pocas semanas para hacer hermosas preparaciones. En general, este protocolo ofrece una forma valiosa de promover la investigación para comprender el desarrollo auditivo, la función y la enfermedad en modelos de ratón.

Introducción

Comprender el desarrollo y la función auditiva es crucial para caracterizar y abordar las diferentes formas de pérdida auditiva. Los factores de riesgo para la pérdida auditiva son muchos e incluyen diabetes ^1,2, hipertensión ^3,4,5, enfermedades autoinmunes ^6,7, meningitis bacteriana ^8,9 y varios trastornos neurodegenerativos 10,11,12,13. Además, ciertos fármacos, como algunos antibióticos y medicamentos de quimioterapia, también pueden afectar negativamente a la audición¹⁴. Más allá de los desafíos inmediatos de la discapacidad auditiva, la pérdida auditiva puede afectar negativamente la función cognitiva y aumentar la ansiedad y el estrés, lo que puede correlacionarse con el deterioro cognitivo y el deterioro de la salud mental 11,15,16. Con la publicación de este protocolo, nuestro objetivo es eliminar cualquier barrera para ingresar a la investigación auditiva, particularmente para aquellos sin experiencia previa trabajando con la cóclea. Esta guía explica cómo preparar muestras del oído interno de ratones embrionarios, juveniles (neonatos) y adultos. El propósito de este protocolo es proporcionar un enfoque sencillo para el procesamiento del tejido del oído interno, asegurando la reproducibilidad y la consistencia en todos los experimentos. La inmunotinción por secciones es uno de los mejores métodos para examinar diferentes tipos de células en el contexto de toda la cóclea; En otras circunstancias, la inmunotinción de montaje completo puede ser más ventajosa (p. ej., examinar la morfología de los estereocilios de las células ciliadas o la localización de proteínas).

La razón de esto se deriva de los desafíos al trabajar con la cóclea del ratón. Su pequeño tamaño, su bobina única y su delicada estructura¹⁷ requieren técnicas especializadas para la disección, fijación, inclusión, criosección e inmunotinción precisas. La forma en espiral de la cóclea significa que la incrustación requiere una cuidadosa atención a la orientación para garantizar que se conserve cada vuelta de la cóclea, lo cual es crucial para obtener secciones consistentes. Además, a medida que la cóclea madura, sufre osificación¹⁸, lo que significa que se transforma gradualmente en hueso, lo que puede complicar la conservación del tejido y requerir descalcificación. La inmunotinción por criosección ofrece varias ventajas sobre las preparaciones alternativas (como la inmunotinción de montaje completo). Los beneficios clave de la criosección son la preservación general de proteínas y ácidos nucleicos, y las secciones relativamente delgadas ~ 2D permiten mediciones consistentes y precisas. Además, permite preservar y visualizar todos los tipos de células cocleares, y puede mejorar la calidad de la inmunotinción. A diferencia de muchas preparaciones cocleares de montaje completo, la criosección preserva estructuras como el ligamento espiral, la estría vascular, la membrana de Reissner y la membrana tectorial. Consulte las siguientes publicaciones anteriores para ver ejemplos de inmunotinción por sección de alta calidad del oído interno embrionario ^19,20,21, neonatal 22,23,24 y ^{adulto 25,26}.

Protocolo

NOTA: Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Georgetown. Todos los ratones en este estudio fueron mantenidos de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgetown (protocolo #1147). En la primera semana postnatal, debido a que las estructuras del hueso temporal no están completamente desarrolladas, no se requiere descalcificación. Sin embargo, las cócleas de ratones P6 o mayores requieren descalcificación y un método diferente de disección. En nuestro protocolo, se utilizaron ratones machos y hembras NCI Cr:NIH(S) (NIH Swiss), y en E16.5, P0 y P30. Para cada sección, anotamos entre paréntesis cuánto tiempo se espera que tome cada paso para los principiantes. Muchos de los pasos se volverán más rápidos con la práctica.

1. Recolección de muestras del oído interno embrionario y juvenil (~75 min)

1. Sacrificar y decapitar ratones de acuerdo con un protocolo de estudio en animales aprobado.
2. Con unas tijeras de disección finas, haga con cuidado una incisión en la línea media a lo largo del cuero cabelludo, comenzando desde el cuello y extendiéndose hacia el hocico, empujando la piel hacia los lados (primer corte).
3. Coloque la hoja de tijera inferior en el foramen magnum y la hoja de tijera superior en el cráneo. Corta la mitad superior del cráneo hasta la nariz (segundo corte).
4. Retira las tijeras de la cabeza parcialmente incisa, luego coloca la hoja de la tijera inferior en la parte inferior del cráneo y las tijeras superiores terminan en el foramen magnum. Corta la mitad inferior de la cabeza hasta la nariz (tercer corte).
   NOTA: Es importante que las hojas de las tijeras corten directamente a través de la línea media y corten fácilmente con poco esfuerzo. Esto asegurará que las hojas de la tijera corten justo entre el oído interno izquierdo y derecho.
5. En este punto, la cabeza del ratón se divide por la mitad a lo largo del eje rostral-caudal. Con pinzas finas y tijeras, separe con cuidado cualquier tejido blando que rodee el hueso temporal, como el cerebro, los músculos y el tejido conectivo. Evite dañar el hueso o las estructuras circundantes.
6. Coloque las medias cabezas del ratón en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contenga 1x PBS a temperatura ambiente. Una vez que se haya procesado cada cabezal, cambie la solución 1x PBS por una solución de PFA al 4% (para la fijación) e incube durante 45 minutos a temperatura ambiente (normalmente 20 °C).
   NOTA: El tiempo de fijación puede variar en función de las proteínas que se necesiten detectar y/o de la eficacia de unión de los diferentes anticuerpos.
7. Después de 45 minutos, enjuague el pañuelo durante 3 x 5-10 minutos con 1x PBS.
8. Almacene las muestras en 1x PBS a 4 °C o vaya al siguiente paso y diseccionarlas. Para almacenamiento a largo plazo, almacenar en 1x PBS que contenga azida de sodio al 0,1% a 4 °C.
9. Deseche cualquier resto de tejido de ratón de acuerdo con las pautas de la institución para la eliminación de tejidos y riesgos biológicos.

2. Disección de muestras de oído interno embrionarias y juveniles (3 a 5 min cada muestra)

1. Localice el hueso temporal/cápsula del oído interno dentro de la mitad de la cabeza del ratón. Ocupa la misma posición que el oído externo, pero está situado dentro del hueso del cráneo. Con pinzas finas, separe con cuidado cualquier tejido blando que rodee la cápsula del oído interno. Una vez que se haya aflojado la cápsula del oído interno, comience a cortar el tejido alrededor de la cápsula del oído interno.
2. Una vez que la cápsula del oído interno se haya liberado en su mayor parte del tejido del cráneo, aplique suavemente presión en el área circundante de la cápsula del oído interno con fórceps para liberarla por completo.
   NOTA: Aplique presión gradual para aflojar la cápsula del oído interno de los accesorios circundantes. Evite dañar la cápsula del oído interno. Debido a que el oído interno de desarrollo temprano es bastante blando, evite hacer contacto directo con sus fórceps.
3. Guarde las muestras del oído interno como en el paso 1.8 y deseche cualquier residuo restante del tejido de la cabeza fijado.

3. Recolección y disección de muestras del oído interno adulto (~75 min + 2 - 3 días de tratamiento con EDTA)

1. Aplicar la eutanasia y decapitar ratones de acuerdo con un protocolo de estudio en animales aprobado.
2. Con unas tijeras de disección afiladas, haga con cuidado una incisión en la línea media a lo largo del cuero cabelludo, comenzando desde el cuello y extendiéndose hacia el hocico. Dobla la piel hacia atrás para exponer el cráneo (primer corte).
3. Coloque la hoja de tijera inferior en el foramen magnum y la hoja de tijera superior en el cráneo. Corta la mitad superior del cráneo hasta la nariz (segundo corte).
   NOTA: Durante este paso, notará un "crujido" moderado de las hojas de las tijeras; Esto es normal.
4. Retira las tijeras de la cabeza parcialmente incisa, luego coloca la hoja de tijera inferior en la parte inferior del cráneo y la hoja de tijera superior en el foramen magnum. Corta la mitad inferior de la cabeza hasta la nariz (tercer corte), teniendo cuidado de ir a lo largo de la línea media para asegurarte de que las hojas no lleguen a las orejas internas.
   NOTA: No fuerce las tijeras a través del pañuelo; Esto podría indicar que las cuchillas golpean uno de los oídos internos.
5. Para cada media cabeza, con pinzas y tijeras, separe cualquier tejido blando que rodee el hueso temporal, como el cerebro, los músculos y el tejido conectivo.
   NOTA: Tenga cuidado de evitar dañar el hueso temporal o las estructuras circundantes.
6. Con el tejido circundante despejado, "enrolle al revés" el tejido del cráneo con los dedos y use un pulgar para aplicar presión suavemente en la parte inferior del hueso temporal. Aplique presión gradual mientras afloja el hueso de sus inserciones circundantes.
   NOTA: A medida que se aplica presión, la cápsula del oído interno se separa gradualmente de los huesos circundantes del cráneo. Con una manipulación suave, el hueso debería salirse con relativa facilidad.
7. Una vez que se haya retirado la cápsula del oído interno, enjuáguela con 1x PBS.
8. Llene un plato de sylgard con un 4% de PFA y colóquelo bajo el microscopio. Coloque un solo oído interno sacado en el plato sylgard.
9. Examine el oído interno en busca de tejido blando o hueso adherido y extraiga suavemente alguno.
10. Busca la ventana oval y retira suavemente el estribo con pinzas.
11. Busca la ventana redonda y haz un pequeño agujero para asegurarte de que ningún pañuelo circundante la obstruya.
12. Abra un pequeño orificio en el ápice con pinzas finas. Enjuague la cóclea con una pipeta P20 llena de PFA al 4 % para fijarla. Asegúrese de visualizar el líquido (sangre diluida, endolinfa/perilinfa) que sale de la ventana oval.
13. Coloque la cóclea fija en una placa de 24 pocillos llena de PFA al 4 %. Marca la hora. Incubar 30-60 min a temperatura ambiente con agitación suave (balancín o nutator), luego enjuagar la muestra durante 3 x 5-10 min con 1x solución de PBS.
14. Después del enjuague final, coloque el pañuelo en EDTA de 1,25 mM y déjelo mecer durante 2-3 días a 4 °C.
15. Deseche el tejido de ratón restante de manera adecuada de acuerdo con las pautas de la institución para la eliminación de tejidos y riesgos biológicos.
16. Después del tratamiento con EDTA, enjuague el pañuelo durante 3 x 5 minutos con 1x PBS.
17. Almacene las muestras en 1x PBS a 4 °C o vaya al siguiente paso y diseccionarlas. Para el almacenamiento a largo plazo, almacene las muestras en 1x PBS que contenga azida de sodio al 0,1% a 4 °C.

4. Preparación de la muestra del oído interno para la criosección (~24 h)

1. Coloque la cápsula de oído interno disecada en sacarosa al 10% (en 1x PBS) y déjela incubar a temperatura ambiente durante un mínimo de 2 h.
   NOTA: Cuando las muestras se hayan equilibrado completamente, se hundirán hasta el fondo del tubo.
2. Deseche la solución de sacarosa al 10%, agregue el 20% de sacarosa en 1x PBS y permita 2 h adicionales de incubación a temperatura ambiente.
3. Deseche la solución de sacarosa al 20%, agregue el 30% de sacarosa en 1x PBS e incube a 4 °C durante la noche (mínimo).
   NOTA: Este paso se puede reducir a 2 h, pero la incubación nocturna produce los mejores resultados. El tejido se puede dejar en cualquier porcentaje de sacarosa durante un período prolongado de tiempo.
   1. Saque la mitad de la solución de sacarosa al 30% y llene el espacio con compuesto de temperatura óptima de corte (OCT). Déjalo mecer durante un mínimo de 30 min y un máximo de 2 h.
      NOTA: Dejar las muestras en OCT durante un tiempo prolongado hará que el tejido se encoja.
4. Transfiera las muestras a criomoldes etiquetados que se llenan con OCT.
5. Compruebe la orientación de la cóclea bajo el microscopio en el criobloque incorporado. En el caso de las secciones transversales cocleares "estándar", confirme que el lado cóncavo del oído interno esté orientado hacia los lados estrechos del criomolde.
6. Coloque el hielo seco en un recipiente pequeño y agregue 5-10 ml de etanol o dimetilbutano. Coloque los criomoldes + OCT + muestra sobre hielo seco burbujeante para congelar rápidamente el bloque.
7. Almacene las muestras a -80 °C.

5. Seccionamiento de los oídos internos (~25 min por muestra)

1. Transfiera los bloques criogénicos a la cámara de un criostato preenfriado a -20 °C. Deje que las muestras se equilibren allí durante 30-60 min.
2. Con un lápiz, marque el lado del criobloque que corresponde a la posición coclear para garantizar la orientación adecuada para el corte.
3. Agregue un pequeño charco de OCT al mandril y coloque el bloque criogénico sobre él, con el lado ancho (sin la marca del lápiz) hacia abajo.
4. Coloque el mandril + OCT + muestra en la cámara de criostato refrigerada, permitiendo que el OCT se congele por completo. Después de unos minutos, coloque el mandril + muestra en el soporte del mandril con la marca del lápiz apuntando hacia la derecha o hacia la izquierda.
5. Recorte el bloque hasta que el tejido sea evidente (use 40 μm como ajuste de recorte).
6. Una vez que el tejido sea evidente, extraiga una sección de 12 μm con portaobjetos diseñados para la criosección y verifique la ubicación de la sección bajo un microscopio.
7. Si se aproxima a los giros cocleares, coseche secciones de 12 μm, verificando la posición de vez en cuando, hasta que pasen todos los giros.
   NOTA: El número de secciones por portaobjetos puede variar, pero normalmente obtenemos de 8 a 10 secciones por portaobjetos, y alrededor de 6 portaobjetos por cóclea.
8. Guarde los portaobjetos a -80 °C.

6. Inmunotinción por sección (~1 - 3 días)

1. Retire los portaobjetos del congelador a -80 °C y déjelos secar al aire durante aproximadamente 10 minutos.
2. Con un lápiz, etiquete los portaobjetos con los anticuerpos que se utilizarán.
3. Traza los bordes con un rotulador hidrofóbico (p. ej., Pluma de barrera hidrofóbica peroxidasa-antiperoxidasa (PAP)).
4. Rehidratar las muestras en 1x PBS durante 5 min.
5. Deseche el 1x PBS de los portaobjetos y añada 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (0,1% PBSTx) a los portaobjetos durante 20 minutos para que se permearan.
6. Retire el 0,1% de PBSTx del portaobjetos y añada 200 μL de la solución de bloqueo para una incubación de 1-2 h a temperatura ambiente.
   NOTA: El bloqueo es un paso crucial en las técnicas de inmunotinción como la inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia, donde evita la unión inespecífica de anticuerpos a tejidos o células. Para más información, véase la guía de Lewis para seleccionar reactivos de control y bloqueo²⁷. Una solución bloqueante comúnmente utilizada es el suero de burro normal al 10% en PBSTx al 0,5%, pero esto solo se aplica cuando se usan anticuerpos secundarios derivados del burro.
7. Realizar un enjuague rápido con 1x PBS, añadir 200 μL de solución de anticuerpos primarios compuesta por PBSTx al 0,5% e incubar durante 1 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C. Para los anticuerpos primarios que se muestran en la Figura 1, utilice las siguientes diluciones: 1:200 para Plexin-B1, 1:200 para Sox2, 1:1.000 para Tuj1, Myo6 y Myo7A (véase también la Lista de materiales).
   NOTA: Cada anticuerpo primario se comporta de manera diferente dependiendo de sus características de unión al epítopo y su capacidad para penetrar muestras de tejido.
8. Después del tratamiento con anticuerpos primarios, enjuagar durante 4 x 30 min en PBSTx, añadir 200 μL de solución de anticuerpos secundarios compuesta por PBSTx al 0,5% (Materials List) e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
   NOTA: A veces puede ser útil centrifugar soluciones de anticuerpos secundarios a toda velocidad a 4 °C durante 30 minutos para granular cualquier precipitado no deseado. Si las soluciones secundarias se han centrifugado, evite tocar el fondo del tubo con la punta de la pipeta.
9. Enjuague durante 4 x 30 minutos en PBSTx (o enjuague durante la noche), luego monte los portaobjetos con un medio de montaje que ayude a prevenir el fotoblanqueo (por ejemplo, Fluoromount).
10. Añada un cubreobjetos del tamaño adecuado con un grosor que sea apropiado para la configuración de la imagen (por ejemplo, cubreobjetos n.º 1, que tienen un grosor de 0,13-0,16 mm).

Resultados

Presentamos ejemplos de nuestro propio laboratorio del ápice y el giro basal de una cóclea de ratón embrionaria de día 16,5 (E16,5) y el giro basal de las cócleas del día postnatal 0 (P0) y P30. Estas muestras han sido seccionadas e inmunoteñidas utilizando marcadores de células ciliadas (Myo7A y Myo6), neuronas ganglionares espirales (SGNs; Tuj1), glía y células de soporte (Sox2), y Plexin-B1, que marca la membrana basal alrededor del conducto coclear y las SGN. Las secciones ...

Discusión

Hay varios pasos clave para el éxito de la criosección y la inmunotinción. La correcta fijación del tejido coclear es esencial, y también lo es la duración de la fijación, que puede variar en función del anticuerpo. Si bien la mayoría de los anticuerpos funcionan mejor con un tiempo de fijación más corto, como 45 min en PFA, algunos epítopos objetivo pueden tolerar la fijación durante la noche. Según nuestra experiencia, una fijación de 45 minutos garantiza una conservaci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	BP151-500
PBS	Corning, Inc.	46-013-CM
EDTA	Sigma-Aldrich, LLC.	60-00-4
Sucrose	VWR International, Inc.	97061-432
Sodium azide	Amresco, Inc.	0639-250G
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714
Ethanol	Decon labs, Inc.	v1001
Dimethylbutane	Thermo Fisher Scientific, Inc.	19387-AP
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	VWR International, Inc.	25608-930
Specific equipment
Cryostat	Thermo Fisher Scientific, Inc.	14-071-459
Disection forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
Hydrophobic Barrier Peroxidase-Antiperoxidase Pen (PAP)	Vector Laboratories, Inc.	H-4000
Confocal Microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC.	LSM 880
P20 micropipette	Gilson, Inc.	F144056M
Dissection scissors	Thermo Fisher Scientific, Inc.	08-951-20
Sylgard dish	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Mounting Materials
Fluoromount	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Superfrost plus slides	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1255015
Immunostaining Reagents
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch, Inc.	017-000-121
Anti-mouse FAB fragments	Jackson ImmunoResearch, Inc.	715-007-003
BlokHen	Aves labs, Inc.	BH-1001
Tuj1 (beta-III-tubulin) mouse monoclonal antibody	Biolegend, Inc.	MMS-435P
Sox2 goat polyclonal antibody	R&D Systems, Inc.	AF2018
Myo6 rabbit polyclonal antibody	Proteus Biosciences	25–6791
Myo7A rabbit polyclonal antibody	Thermo Fisher Scientific, Inc.	PA1-936
Plexin-B1 goat polyclonal antibody	R&D Systems, Inc.	AF3749
Secondary antibodies (made in donkey; Alexa-488, Cy3, Cy5)	Jackson ImmunoResearch, Inc.	see catalog