マウス内耳組織の凍結切片および免疫染色:胚期から成虫期まで

要約

このプロトコルは、マウス内耳組織の初心者ユーザーを対象としており、切片免疫染色のためのさまざまな発生段階でマウス内耳を処理する手順を包括的に詳しく説明しています。

要約

このプロトコルでは、胚、新生児、および成体マウスから内耳サンプルを調製するための一般的な組織学方法を詳しく説明しています。このプロトコルの目的は、マウス蝸牛の研究に関心のある、おそらくこの分野に不慣れな研究者に、内耳組織処理のための簡単で標準化された方法を提供することです。ここには、解剖、固定、包埋、凍結切片、および免疫染色のプロトコルが含まれています。切片免疫染色は、蝸牛全体の状況下で個々の細胞を調べるための最良の方法の1つです。

主なステップには、頭蓋骨から離れた内耳の切開、4%パラホルムアルデヒドを使用した組織固定、Optimal Cutting Temperatureコンパウンドの埋め込み、凍結切片、蝸牛によって発現される特定のタンパク質を標的とする抗体による免疫染色が含まれます。

私たちの方法には、蝸牛のために作られた特別な考慮事項が含まれています。
形状と構造。組織の損傷は免疫染色の質とサンプル間の一貫性に影響を与える可能性があるため、適度に優れた集中力と解剖スキルが必要です。ただし、ここで概説する手順を使用すると、ほとんどのユーザーは数週間で美しい準備をするためのトレーニングを受けることができます。全体として、このプロトコルは、マウスモデルの聴覚発達、機能、および疾患を理解するための研究を促進するための貴重な方法を提供します。

概要

聴覚の発達と機能を理解することは、さまざまな形態の難聴を特徴付け、対処するために重要です。難聴の危険因子は多く、糖尿病^1,2、高血圧^3,4,5、自己免疫疾患^6,7、細菌性髄膜炎^8,9、およびいくつかの神経変性疾患10,11,12,13が含まれます.さらに、一部の抗生物質や化学療法薬などの特定の薬物も、聴力に悪影響を与える可能性があります¹⁴。聴覚障害の差し迫った課題を超えて、難聴は認知機能に悪影響を及ぼし、不安やストレスを増大させる可能性があり、これは認知障害やメンタルヘルスの低下と相関する可能性があります11,15,16。このプロトコルを公開することで、特に蝸牛の作業経験がない人にとって、聴覚研究に参加する際の障壁を緩和することを目指しています。このガイドでは、胚マウス、若年マウス(新生児マウス)、成体マウスの内耳サンプルの調製方法について説明します。このプロトコルの目的は、内耳組織処理への直接的なアプローチを提供し、実験間の再現性と一貫性を確保することです。切片免疫染色は、蝸牛全体の状況でさまざまな細胞タイプを調べるための最良の方法の1つです。他の状況では、ホールマウント免疫染色がより有利な場合があります(例:有毛細胞の立体繊毛の形態またはタンパク質の局在を調べる)。

この理論的根拠は、マウス蝸牛を扱う際の課題に起因しています。その小型でユニークなコイル、および繊細な構造¹⁷は、正確な解剖、固定、包埋、凍結切片、および免疫染色のための専門的な技術を必要とします。蝸牛の螺旋形状は、埋め込みには、蝸牛の各ターンが保持されるように向きに細心の注意を払う必要があることを意味し、これは一貫した切片を得るために重要です。さらに、蝸牛が成熟するにつれて、蝸牛は骨化¹⁸を受け、徐々に骨に変化するため、組織の保存が複雑になり、脱灰が必要になる可能性があります。クライオ切片免疫染色には、代替製剤(ホールマウント免疫染色など)に比べていくつかの利点があります。クライオ切片の主な利点は、タンパク質と核酸の一般的な保存であり、比較的薄い~2D切片により、一貫性のある正確な測定が可能になります。さらに、すべての蝸牛細胞の種類を保存および視覚化することができ、免疫染色の品質を向上させることができます。多くの蝸牛ホールマウント製剤とは異なり、凍結切片は、らせん靭帯、血管線条体、ライスナー膜、および皮膚膜などの構造を保持します。胚19,20,21、新生児22,23,24、および成人^25,26の内耳の高品質な切片免疫染色の例については、以下の先行論文を参照してください。

プロトコル

注:ここに記載されているすべての方法は、ジョージタウン大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。この研究に参加したすべてのマウスは、ジョージタウン大学の動物管理委員会(プロトコル#1147)に従って飼育されました。出生後最初の週には、側頭骨構造が完全に発達していないため、脱灰は必要ありません。ただし、P6 以上のマウスの蝸牛には、脱灰と別の解剖方法が必要です。私たちのプロトコルでは、オスとメスのNCI Cr:NIH(S)(NIH Swiss)マウスを使用し、E16.5、P0、およびP30で使用しました。各セクションについて、初心者が各ステップにかかる時間を括弧内に書き留めています。多くのステップは練習を重ねれば速くなっていきます。

1. 胚および幼若の内耳サンプル採取 (~75 分)

1. 承認された動物研究プロトコルに従ってマウスを安楽死させ、首を切る。
2. 細かい解剖ハサミを使用して、首から鼻に向かって伸びる頭皮に沿って正中線を慎重に切り込み、皮膚を横に押します(最初のカット)。
3. 下部のはさみ刃を大孔に、上部のはさみ刃を頭蓋骨に置きます。頭蓋骨の上半分を鼻まで切ります(2回目の切り込み)。
4. 部分的に切開した頭からハサミを戻し、次に下部のはさみの刃を頭蓋骨の下部に置き、上部のはさみの端を大孔に置きます。頭の下半分を鼻まで切ります(3回目の切り口)。
   注:はさみの刃が正中線を正しく切り込み、少しの力で簡単に切断できることが重要です。これにより、はさみの刃が左右の内耳の間に正しく切り込むようになります。
5. この時点で、マウスの頭は吻側 - 尾側軸に沿って半分に分割されます。細い鉗子やハサミを使って、脳、筋肉、結合組織など、側頭骨の周囲の軟組織を慎重に取り除きます。骨や周囲の構造物を傷つけないようにしてください。
6. マウスのハーフヘッドを、室温の1x PBSを含む24ウェルプレートのウェルに入れます。各ヘッドが処理されたら、1x PBS溶液を4% PFA溶液(固定用)と交換し、室温(通常は20°C)で45分間インキュベートします。
   注:固定時間は、検出する必要があるタンパク質および/または異なる抗体の結合効果によって異なる場合があります。
7. 45分後、1x PBSで3 x 5〜10分間ティッシュをすすぎます。
8. サンプルを1x PBSに4°Cで保存するか、次のステップに進んでサンプルを解剖します。長期保存する場合は、0.1%アジ化ナトリウムを含む1x PBSに4°Cで保存してください。
9. 残っているマウス組織は、バイオハザード/組織廃棄に関する施設のガイドラインに従って廃棄してください。

2.胚および幼若の内耳サンプル解剖(各サンプル3〜5分)

1. マウスの半頭内の側頭骨/内耳嚢を見つけます。外耳と同じ位置を占めていますが、頭蓋骨の内側に位置しています。細い鉗子を使用して、内耳嚢の周囲の軟部組織を慎重に取り除きます。内耳包が緩んだら、内耳包の周りの組織を切断し始めます。
2. 内耳包が頭蓋骨組織からほとんど解放されたら、鉗子を使用して内耳嚢の周囲に静かに圧力をかけ、完全に解放します。
   注意: 徐々に圧力をかけて、内耳嚢を周囲のアタッチメントから緩めます。内耳のカプセルを傷つけないようにしてください。初期に発達した内耳は非常に柔らかいため、鉗子に直接触れることは避けてください。
3. ステップ1.8のように内耳のサンプルを保管し、固定された頭部組織から残っている破片を捨てます。

3.成人の内耳サンプルの収集と解剖(~75分+2〜3日間のEDTA治療)

1. 承認された動物研究プロトコルに従ってマウスを安楽死させ、首を切る。
2. 鋭利な解剖ハサミを使用して、首から鼻に向かって伸びる頭皮に沿って慎重に正中線を切開します。皮膚を折り返して頭蓋骨を露出させます(最初のカット)。
3. 下部のはさみ刃を大孔に、上部のはさみ刃を頭蓋骨に置きます。頭蓋骨の上半分を鼻まで切ります(2回目の切り込み)。
   注:この手順では、はさみの刃が適度に「クランチ」していることに気付くでしょう。これは正常です。
4. 部分的に切開した頭からハサミを戻し、下部のシザーブレードを頭蓋骨の下部に、上部のシザーブレードを大孔に置きます。頭の下半分を鼻まで切り取り(3回目のカット)、刃が内耳を逃すように正中線に沿って右に進むように注意します。
   注意: はさみを組織に無理に押し込まないでください。これは、ブレードが内耳の1つに当たっていることを示している可能性があります。
5. 各ハーフヘッドについて、鉗子とはさみを使用して、脳、筋肉、結合組織など、側頭骨の周囲の軟組織を剥離します。
   注意: 側頭骨や周囲の構造を傷つけないように注意してください。
6. 周囲の組織をきれいにした状態で、指で頭蓋骨組織を「逆カール」させ、親指を使って側頭骨の下側に優しく圧力をかけます。ボーンを周囲のアタッチメントから緩めながら、徐々に圧力をかけます。
   注:圧力がかかると、内耳嚢は頭蓋骨の周囲の骨から徐々に分離します。穏やかな操作で、骨は比較的簡単に飛び出すはずです。
7. 内耳嚢を取り外したら、1x PBSですすいでください。
8. シルガード皿に4%PFAを充填し、顕微鏡下に置きます。シルガード皿に飛び出した内耳を1つ置きます。
9. 内耳に付着した軟部組織や骨がないか調べ、そっと取り除きます。
10. 楕円形の窓を見つけ、鉗子でアブミ骨をそっと取り除きます。
11. 丸い窓を見つけて小さな穴を開け、周囲のティッシュが詰まっていないことを確認します。
12. 細かい鉗子で頂点に小さな穴を開けます。4% PFAを充填したP20ピペットで蝸牛を洗い流して固定します。楕円形の窓から出てくる液体(希釈された血液、内リンパ/周囲)を必ず視覚化してください。
13. 固定蝸牛を 4% PFA で満たされた 24 ウェルプレートに入れます。時間をマークします。室温で30〜60分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートし(ロッカーまたはニューテーター)、次にサンプルを1x PBS溶液で3×5〜10分間すすぎます。
14. 最終すすぎ後、組織を1.25 mM EDTAに置き、4°Cで2〜3日間揺とうします。
15. 残ったマウス組織は、施設のバイオハザード/組織廃棄に関するガイドラインに従って適切に廃棄してください。
16. EDTA処理後、1x PBSで組織を3 x 5分間すすぎます。
17. サンプルを1x PBSに4°Cで保存するか、次のステップに進んでサンプルを解剖します。長期保存の場合は、0.1%アジ化ナトリウムを含む1x PBSにサンプルを4°Cで保存します。

4. クライオセクショニングのための内耳サンプル調製 (~24 時間)

1. 解剖した内耳カプセルを10%スクロース(1x PBS)に入れ、室温で最低2時間インキュベートします。
   注:サンプルが完全に平衡化すると、サンプルはチューブの底に沈みます。
2. 10%スクロース溶液を捨て、1x PBSに20%スクロースを加え、室温でさらに2時間インキュベートします。
3. 20%スクロース溶液を廃棄し、1x PBSに30%スクロースを加え、4°Cで一晩(最低)インキュベートします。
   注:このステップは2時間まで短縮できますが、一晩インキュベートすると最良の結果が得られます。組織は、任意の割合のスクロースに長時間放置することができます。
   1. 30%ショ糖溶液の半分を取り出し、最適切断温度(OCT)コンパウンドでスペースを満たします。最低30分、最大2時間揺らします。
      注:サンプルをOCTに長時間放置すると、組織が収縮します。
4. OCTを充填した標識クライオモールドにサンプルを移します。
5. 埋め込まれたクライオブロックの顕微鏡下で蝸牛の向きを確認します。「標準」の蝸牛断面の場合、内耳の凹面がクライオモールドの狭い面に面していることを確認します。
6. ドライアイスを小さな容器に入れ、5〜10mLのエタノールまたはジメチルブタンを加えます。クライオモールド+ OCT +サンプルを泡立つドライアイスに置き、ブロックを急速に凍結します。
7. サンプルは-80°Cで保存します。

5. 内耳の切片作成 (~25 分/サンプル)

1. クライオブロックを-20°Cに予冷したクライオスタットのチャンバーに移します。 サンプルをそこで30〜60分間平衡化させます。
2. 鉛筆を使用して、蝸牛の位置に対応するクライオブロックの側面に印を付け、切片作成の適切な向きを確保します。
3. チャックにOCTの小さなプールを追加し、クライオブロックをその上に、幅の広い側(鉛筆のマークなし)を下にして置きます。
4. チャック + OCT + サンプルを冷却したクライオスタットチャンバーに入れ、OCTを完全に凍結させます。数分後、チャック+サンプルをチャックホルダーに置き、鉛筆のマークを右または左に向けてください。
5. 組織が明らかになるまでブロックをトリミングします(トリム設定として40μmを使用します)。
6. 組織が明らかになったら、凍結切片用に設計されたスライドで12 μmの切片を採取し、顕微鏡で切片化位置を確認します。
7. 蝸牛のターンに近づく場合は、12 μmの切片を採取し、すべてのターンを過ぎるまで時々位置を確認します。
   注:スライドあたりのセクション数はさまざまですが、通常はスライドごとに8〜10セクション、蝸牛ごとに約6枚のスライドがあります。
8. スライドは-80°Cで保管してください。

6. 切片免疫染色(~1 - 3日)

1. スライドを-80°Cの冷凍庫から取り出し、約10分間風乾させます。
2. 鉛筆を使用して、使用する抗体をスライドにラベル付けします。
3. 疎水性マーカー(例:Hydrophobic Barrier Peroxidase-Antiperoxidase Pen(PAP))を使用してエッジをトレースします。
4. 1x PBSでサンプルを5分間再水和します。
5. スライドから1x PBSを廃棄し、1x PBS + 0.1% Triton X-100(0.1% PBSTx)をスライドに20分間加えて透過処理します。
6. スライドから0.1% PBSTxを除去し、ブロッキング溶液200 μLを加えて室温で1-2時間のインキュベーションを行います。
   注:ブロッキングは、免疫組織化学や免疫蛍光などの免疫染色技術における重要なステップであり、抗体の組織や細胞への非特異的結合を防ぎます。詳細については、Lewisのコントロール試薬およびブロッキング試薬の選択に関するガイド²⁷を参照のこと。一般的に使用されるブロッキング溶液は、0.5% PBSTx 中の 10% Normal Donkey Serum ですが、これはロバ由来の二次抗体を使用する場合にのみ適用されます。
7. 1x PBSで素早くすすぎ、0.5% PBSTxで調製した一次抗体溶液200 μLを加え、室温で1時間または4°Cで一晩インキュベートします。 図1に示す一次抗体については、Plexin-B1に1:200、Sox2に1:200、Tuj1、Myo6、Myo7Aにそれぞれ1:1,000の希釈度を使用してください( 材料リストも参照)。
   注:すべての一次抗体は、そのエピトープ結合特性と組織サンプルに浸透する能力に応じて異なる振る舞いをします。
8. 一次抗体で処理した後、PBSTxで4×30分間すすぎ、0.5% PBSTxで調製した二次抗体溶液200μL(Materials List)を加え、室温で1時間インキュベートします。
   注:二次抗体溶液を4°Cで30分間全速力で遠心して、不要な沈殿物をペレット化すると役立つ場合があります。二次溶液が遠心分離されている場合は、ピペットチップでチューブの底部に触れないようにしてください。
9. PBSTxで30分間4回すすぎ(または一晩すすぎ)、光退色を防ぐ封入剤(Fluoromountなど)を使用してスライドを埋込します。
10. イメージングセットアップに適した厚さの適切なサイズのカバースリップを追加します(たとえば、厚さが0.13〜0.16 mmのNo.1カバースリップ)。

結果

私たちは、胚の16.5日目(E16.5)マウス蝸牛の頂点と基底回転、および出生後0日目(P0)とP30蝸牛の基底回転の私たち自身の研究室からの例を紹介します。これらのサンプルは、有毛細胞(Myo7AおよびMyo6)、スパイラル神経節ニューロン(SGN;Tuj1)、グリアおよび支持細胞(Sox2)、および蝸牛管とSGNの周りの基底膜を標識するPlexin-B1。さまざまな発達段階における蝸牛の断面は、蝸?...

ディスカッション

凍結切片と免疫染色を成功させるには、いくつかの重要なステップがあります。蝸牛組織の適切な固定が不可欠であり、固定の持続時間も重要ですが、これは抗体によって異なります。ほとんどの抗体は、PFAで45分などの短い固定時間でよりよく機能しますが、一部の標的エピトープは一晩の固定に耐えることができます。私たちの経験に基づくと、45分間の固定は?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	BP151-500
PBS	Corning, Inc.	46-013-CM
EDTA	Sigma-Aldrich, LLC.	60-00-4
Sucrose	VWR International, Inc.	97061-432
Sodium azide	Amresco, Inc.	0639-250G
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714
Ethanol	Decon labs, Inc.	v1001
Dimethylbutane	Thermo Fisher Scientific, Inc.	19387-AP
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	VWR International, Inc.	25608-930
Specific equipment
Cryostat	Thermo Fisher Scientific, Inc.	14-071-459
Disection forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
Hydrophobic Barrier Peroxidase-Antiperoxidase Pen (PAP)	Vector Laboratories, Inc.	H-4000
Confocal Microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC.	LSM 880
P20 micropipette	Gilson, Inc.	F144056M
Dissection scissors	Thermo Fisher Scientific, Inc.	08-951-20
Sylgard dish	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Mounting Materials
Fluoromount	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Superfrost plus slides	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1255015
Immunostaining Reagents
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch, Inc.	017-000-121
Anti-mouse FAB fragments	Jackson ImmunoResearch, Inc.	715-007-003
BlokHen	Aves labs, Inc.	BH-1001
Tuj1 (beta-III-tubulin) mouse monoclonal antibody	Biolegend, Inc.	MMS-435P
Sox2 goat polyclonal antibody	R&D Systems, Inc.	AF2018
Myo6 rabbit polyclonal antibody	Proteus Biosciences	25–6791
Myo7A rabbit polyclonal antibody	Thermo Fisher Scientific, Inc.	PA1-936
Plexin-B1 goat polyclonal antibody	R&D Systems, Inc.	AF3749
Secondary antibodies (made in donkey; Alexa-488, Cy3, Cy5)	Jackson ImmunoResearch, Inc.	see catalog