냉동 절제 및 면역 염색 마우스 내이 조직: 배아에서 성체 단계까지

요약

생쥐 내이 조직의 초보 사용자를 위한 이 프로토콜은 단면 면역 염색을 위한 다양한 발달 단계에서 생쥐 내이를 처리하는 단계를 포괄적으로 자세히 설명합니다.

초록

이 프로토콜은 배아, 신생아 및 성체 마우스의 내이 샘플을 준비하기 위한 일반적인 조직학 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜의 목적은 쥐 달팽이관 작업에 관심이 있는 이 분야에 처음 접할 수 있는 연구자에게 내이 조직 처리를 위한 간단하고 표준화된 방법을 제공하는 것입니다. 여기에는 해부, 고정, 포매, 동결 절제 및 면역 염색을 위한 프로토콜이 포함되어 있습니다. 단면 면역염색은 전체 달팽이관의 맥락에서 개별 세포를 검사하는 가장 좋은 방법 중 하나입니다.

주요 단계에는 두개골에서 내이를 절개하고, 4% 파라포름알데히드를 사용하여 조직을 고정하고, 최적 절단 온도 화합물을 삽입하고, 동결 절제하고, 달팽이관에서 발현되는 특정 단백질을 표적으로 하는 항체로 면역 염색하는 것이 포함됩니다.

우리의 방법에는 달팽이관에 대한 특별한 고려 사항이 포함되어 있습니다.
모양과 구조. 조직 손상은 면역 염색의 품질과 검체 간의 일관성에 영향을 미칠 수 있으므로 상당히 우수한 초점 및 해부 기술이 필요합니다. 그러나 우리가 설명하는 절차를 통해 대부분의 사용자는 몇 주 안에 멋진 준비를 할 수 있도록 교육을 받을 수 있습니다. 전반적으로 이 프로토콜은 마우스 모델의 청각 발달, 기능 및 질병을 이해하기 위한 연구를 촉진하는 귀중한 방법을 제공합니다.

서문

청각 발달 및 기능을 이해하는 것은 다양한 형태의 난청을 특성화하고 해결하는 데 중요합니다. 난청의 위험 요인은 당뇨병 ^1,2, 고혈압 ^3,4,5, 자가면역 질환 ^6,7, 세균성 뇌수막염 ^8,9, 여러 신경퇴행성 질환 10,11,12,13 등 다양합니다. 또한 일부 항생제 및 화학 요법 약물과 같은 특정 약물도 청력에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다¹⁴. 청각 장애라는 즉각적인 문제 외에도 난청은 인지 기능에 부정적인 영향을 미치고 불안과 스트레스를 증가시킬 수 있으며, 이는 인지 장애 및 정신 건강 저하와 상관관계가 있을 수 있습니다 11,15,16. 이 프로토콜을 발표함으로써 우리는 특히 달팽이관에 대한 사전 경험이 없는 사람들을 위해 청각 연구에 진입하는 데 대한 모든 장벽을 완화하는 것을 목표로 합니다. 이 가이드는 배아, 청소년(신생아) 및 성체 마우스의 내이 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 목적은 내이 조직 처리에 대한 간단한 접근 방식을 제공하여 실험 전반에 걸쳐 재현성과 일관성을 보장하는 것입니다. 단면 면역염색은 전체 달팽이관의 맥락에서 다양한 세포 유형을 검사하는 가장 좋은 방법 중 하나입니다. 다른 상황에서는 전체 마운트 면역 염색이 더 유리할 수 있습니다(예: 유모 세포 입체섬모 형태 또는 단백질 국소화 검사).

이에 대한 근거는 쥐 달팽이관을 다루는 데 따르는 어려움에서 비롯됩니다. 작은 크기, 독특한 코일 및 섬세한 구조¹⁷는 정확한 해부, 고정, 포매, 동결 절제 및 면역 염색을 위한 특수 기술을 필요로 합니다. 달팽이관의 나선형 모양은 달팽이관이 회전할 때마다 보전되도록 하기 위해 삽입을 위해 방향에 세심한 주의를 기울여야 한다는 것을 의미하며, 이는 일관된 절편을 얻는 데 중요합니다. 또한, 달팽이관이 성숙해짐에 따라 골화(ossification¹⁸)를 겪게 되는데, 이는 점차적으로 뼈로 변형된다는 것을 의미하며, 이는 조직 보존을 복잡하게 만들고 석회질 제거를 필요로 할 수 있습니다. 초저온 절편 면역염색은 대체 제제(예: 전체 마운트 면역염색)에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 동결 절편의 주요 이점은 단백질과 핵산의 일반적인 보존이며, 상대적으로 얇은 ~2D 절편으로 일관되고 정밀한 측정이 가능하다는 것입니다. 또한 모든 달팽이관 세포 유형을 보존하고 시각화할 수 있으며 면역 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다. 많은 달팽이관 전체 마운트 제제와 달리 냉동 절제는 나선형 인대, 선조체 혈관, 라이스너 막(Reissner's membrane) 및 구조막(tectorial membrane)을 포함한 구조를 보존합니다. 배아 19,20,21, 신생아 ^22,23,24 및 성인 ^25,26 내이의 고품질 단면 면역염색의 예에 대해서는 다음 이전 간행물을 참조하십시오.

프로토콜

참고: 여기에 설명된 모든 방법은 조지타운 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 연구의 모든 마우스는 Georgetown University Institutional Animal Care and Use Committee(프로토콜 #1147)에 따라 유지되었습니다. 출생 후 첫 주에는 측두골 구조가 완전히 발달하지 않았기 때문에 석회질 제거가 필요하지 않습니다. 그러나 P6 이상 마우스의 달팽이관은 석회질 제거와 다른 해부 방법이 필요합니다. 본 임상시험계획서에서는 수컷 및 암컷 NCI Cr:NIH(S) (NIH Swiss) 마우스를 E16.5, P0 및 P30에서 사용하였다. 각 섹션에 대해 괄호 안에 초보자에게 각 단계가 얼마나 오래 걸릴 것으로 예상되는지 표시합니다. 많은 단계가 연습을 통해 더 빨라질 것입니다.

1. 배아 및 청소년 내이 샘플 수집(~75분)

1. 승인된 동물 연구 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시키고 목을 베십시오.
2. 미세한 절개 가위를 사용하여 목에서 시작하여 쪽으로 두피를 따라 정중선을 조심스럽게 절개하여 피부를 옆으로 밀어 넣습니다(첫 번째 절단).
3. 아래쪽 가위날을 유공(foramen magnum)에 놓고 위쪽 가위날을 두개골에 놓습니다. 두개골의 위쪽 절반을 코까지 자릅니다(두 번째 절단).
4. 부분적으로 절개 된 머리에서 가위를 뒤로 빼낸 다음 아래쪽 가위 날을 두개골 아래쪽에 놓고 위쪽 가위 끝을 구멍 매그넘에 놓습니다. 머리의 아래쪽 절반을 코까지 자릅니다(세 번째 컷).
   알림: 가위 날이 정중선을 바로 절단하고 적은 노력으로 쉽게 절단하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 가위날이 왼쪽과 오른쪽 내이 사이를 절단할 수 있습니다.
5. 이 시점에서 쥐 머리는 꼬리 축을 따라 반으로 나뉩니다. 가는 집게와 가위를 사용하여 뇌, 근육, 결합 조직과 같이 측두골을 둘러싼 연조직을 조심스럽게 분리한다. 뼈나 주변 구조물의 손상을 피하십시오.
6. 실온 24x PBS가 포함된 1웰 플레이트의 웰에 마우스 반쪽 머리를 놓습니다. 각 헤드가 처리되면 1x PBS 용액을 4% PFA 용액(고정용)으로 교환하고 실온(일반적으로 20°C)에서 45분 동안 배양합니다.
   참고: 고정 시간은 검출해야 하는 단백질 및/또는 다른 항체의 결합 효능에 따라 달라질 수 있습니다.
7. 45분 후, 1x PBS로 3 x 5-10분 동안 조직을 헹굽니다.
8. 4°C의 1x PBS에 시료를 보관하거나 다음 단계로 이동하여 해부합니다. 장기 보관의 경우 4°C에서 0.1% 아지드화나트륨이 함유된 1x PBS에 보관하십시오.
9. 생물학적 위험/조직 처리에 대한 기관의 지침에 따라 남아 있는 마우스 조직을 폐기하십시오.

2. 배아 및 청소년 내이 샘플 박리 (각 샘플 3 - 5분)

1. 마우스의 반쪽 머리 내에서 측두골/내이 캡슐을 찾습니다. 외이와 같은 위치를 차지하지만 두개골 뼈 내부에 있습니다. 가는 집게를 사용하여 내이낭을 둘러싼 연조직을 조심스럽게 분리합니다. 내이낭이 느슨해지면 내이낭 주위의 조직을 절단하기 시작합니다.
2. 내이낭이 두개골 조직에서 대부분 분리되면 집게를 사용하여 내이낭 주변에 부드럽게 압력을 가하여 완전히 풀어냅니다.
   알림: 서서히 압력을 가하여 내이 캡슐을 주변 부착물에서 느슨하게 합니다. 내이낭이 손상되지 않도록 하십시오. 초기에 발달하는 내이는 매우 부드럽기 때문에 집게에 직접 닿지 않도록 합니다.
3. 내이 샘플을 1.8단계와 같이 보관하고 고정된 머리 조직에 남아 있는 파편은 모두 버립니다.

3. 성인 내이 샘플 채취 및 해부 (~ 75 분 + EDTA 치료 2-3 일)

1. 승인된 동물 연구 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시키고 목을 베십시오.
2. 날카로운 절개 가위를 사용하여 두피를 따라 목에서 시작하여 쪽으로 정중선을 조심스럽게 절개합니다. 두개골이 드러나도록 피부를 뒤로 접습니다(첫 번째 절단).
3. 아래쪽 가위날을 유공(foramen magnum)에 놓고 위쪽 가위날을 두개골에 놓습니다. 두개골의 위쪽 절반을 코까지 자릅니다(두 번째 절단).
   알림: 이 단계에서는 가위 날의 적당한 "크런치"를 느낄 수 있습니다. 이것은 정상입니다.
4. 부분적으로 절개 된 머리에서 가위를 뒤로 빼낸 다음 아래쪽 가위 날을 두개골 아래쪽에 놓고 위쪽 가위 날을 구멍 매그넘에 놓습니다. 머리의 아래쪽 절반을 코까지 자르고(세 번째 절단), 칼날이 내이를 놓치도록 정중선을 따라 오른쪽으로 가도록 주의합니다.
   알림: 티슈를 통해 가위를 억지로 밀어 넣지 마십시오. 이것은 칼날이 내이 중 하나를 때리고 있음을 나타낼 수 있습니다.
5. 각 반쪽 머리에 대해 집게와 가위를 사용하여 뇌, 근육 및 결합 조직과 같은 측두골을 둘러싼 모든 연조직을 분리하십시오.
   알림: 측두골이나 주변 구조가 손상되지 않도록 주의하십시오.
6. 주변 조직을 청소한 후 손가락으로 두개골 조직을 "리버스 컬링"하고 엄지 손가락을 사용하여 측두골 아래쪽에 부드럽게 압력을 가합니다. 주변 부착물에서 뼈를 느슨하게 하면서 서서히 압력을 가합니다.
   참고: 압력이 가해지면 내이낭이 두개골의 주변 뼈에서 점차 분리됩니다. 부드럽게 조작하면 뼈가 비교적 쉽게 튀어나와야 합니다.
7. 내이캡슐을 제거한 후 PBS 1개로 헹굽니다.
8. 실가드 접시에 4% PFA를 채우고 현미경 아래에 놓습니다. 튀어나온 내이 하나를 실가드 접시에 넣습니다.
9. 내이에 부착된 연조직이나 뼈가 있는지 검사하고 부드럽게 제거합니다.
10. 타원형 창을 찾아 집게로 등골을 부드럽게 제거합니다.
11. 둥근 창을 찾아 작은 구멍을 뚫어 주변 조직이 막고 있지 않은지 확인합니다.
12. 가는 집게로 정점에 있는 작은 구멍을 엽니다. 4% PFA로 채워진 P20 피펫으로 달팽이관을 세척하여 고정합니다. 타원형 창에서 나오는 액체(묽은 혈액, 내림프/둘레림프)를 시각화해야 합니다.
13. 고정된 달팽이관을 4% PFA로 채워진 24웰 플레이트에 넣습니다. 시간을 표시합니다. 실온에서 부드러운 교반(로커 또는 너트레이터)으로 30-60분 동안 배양한 다음 1x PBS 용액으로 3 x 5-10분 동안 샘플을 헹굽니다.
14. 최종 헹굼 후 조직을 1.25mM EDTA에 놓고 4°C에서 2-3일 동안 흔들리게 합니다.
15. 남은 마우스 조직은 생물학적 위험/조직 처리에 대한 기관의 지침에 따라 적절하게 폐기합니다.
16. EDTA 치료 후 1x PBS로 3 x 5분 동안 조직을 헹굽니다.
17. 4°C의 1x PBS에 시료를 보관하거나 다음 단계로 이동하여 해부합니다. 장기 보관을 위해 4°C에서 0.1% 아지드화나트륨이 함유된 1x PBS에 샘플을 보관하십시오.

4. 냉동 절편을 위한 내이 시료 준비(~24시간)

1. 절개된 내이 캡슐을 10% 자당(1x PBS 중)에 넣고 실온에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
   참고: 샘플이 완전히 평형을 이루면 튜브 바닥으로 가라앉습니다.
2. 10% 자당 용액을 버리고 1x PBS에 20% 자당을 첨가한 후 실온에서 추가로 2시간 동안 배양합니다.
3. 20% 자당 용액을 버리고 1x PBS에 30% 자당을 첨가한 다음 4°C에서 하룻밤(최소) 배양합니다.
   참고: 이 단계는 2시간으로 줄일 수 있지만 하룻밤 배양하면 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 조직은 장기간 동안 자당의 어떤 비율로든 남아 있을 수 있습니다.
   1. 30% 자당 용액의 절반을 꺼내고 최적 절단 온도(OCT) 화합물로 공간을 채웁니다. 최소 30분에서 최대 2시간 동안 흔들어 두십시오.
      참고: 샘플을 OCT에 장기간 방치하면 조직이 수축할 수 있습니다.
4. 샘플을 OCT로 채워진 라벨링된 cryomold로 옮깁니다.
5. 내장된 cryoblock의 현미경 아래에서 달팽이관 방향을 확인합니다. "표준" 달팽이관 단면의 경우, 내이의 오목한 면이 cryomold의 좁은 면을 향하고 있는지 확인합니다.
6. 드라이 아이스를 작은 용기에 넣고 5-10mL의 에탄올 또는 디메틸 부탄을 넣으십시오. cryomolds + OCT + sample을 거품이 나는 드라이 아이스에 올려 블록을 빠르게 얼립니다.
7. 샘플을 -80 °C에서 보관하십시오.

5. 내이 절편(샘플당 ~25분)

1. cryoblocks를 -20 °C로 사전 냉각된 저온 유지 장치의 챔버로 옮깁니다. 샘플이 30-60분 동안 평형을 이루도록 합니다.
2. 연필을 사용하여 달팽이관 위치에 해당하는 크라이오블록의 측면을 표시하여 절단을 위한 적절한 방향을 확인합니다.
3. 척에 작은 OCT 풀을 추가하고 넓은 면(연필 자국 없음)이 아래로 향하게 하여 크라이오블록을 놓습니다.
4. 척 + OCT + 샘플을 냉각된 저온 유지 장치 챔버에 넣어 OCT가 완전히 얼도록 합니다. 몇 분 후 척 + s를 놓습니다.amp연필 표시가 오른쪽 또는 왼쪽을 가리키도록 척 홀더에 놓습니다.
5. 조직이 뚜렷해질 때까지 블록을 트리밍합니다(트리밍 설정으로 40μm 사용).
6. 조직이 분명해지면 동결 절편을 위해 설계된 슬라이드가 있는 12μm 절편을 채취하고 현미경으로 절편 위치를 확인합니다.
7. 달팽이관 회전에 접근하는 경우 12μm 절편을 수확하고 모든 회전이 지날 때까지 가끔 위치를 확인합니다.
   참고: 슬라이드당 섹션 수는 다를 수 있지만 일반적으로 슬라이드당 8-10개의 섹션, 달팽이관당 약 6개의 슬라이드가 있습니다.
8. 슬라이드는 -80°C에서 보관하십시오.

6. 단면 면역염색 (~1 - 3일)

1. -80°C 냉동고에서 슬라이드를 제거하고 약 10분 동안 자연 건조시킵니다.
2. 연필을 사용하여 사용할 항체로 슬라이드에 레이블을 지정합니다.
3. 소수성 마커(예: Hydrophobic Barrier Peroxidase-Antiperoxidase Pen (PAP))를 사용하여 가장자리를 추적합니다.
4. 1x PBS에서 5분 동안 샘플을 재수화합니다.
5. 슬라이드에서 1x PBS를 버리고 1x PBS + 0.1% Triton X-100 (0.1% PBSTx)을 슬라이드에 20분 동안 추가하여 투과시킵니다.
6. 슬라이드에서 0.1% PBSTx를 제거하고 실온에서 1-2시간 배양을 위해 차단 용액 200μL를 추가합니다.
   참고: 차단은 면역조직화학 및 면역형광과 같은 면역염색 기술에서 중요한 단계로, 항체가 조직이나 세포에 비특이적으로 결합하는 것을 방지합니다. 자세한 내용은 Lewis의 guide to selecting control and blocking reagents²⁷을 참조하십시오. 일반적으로 사용되는 차단 솔루션은 0.5% PBSTx 10% 노멀 당나귀 혈청이지만, 이는 당나귀에서 유래한 2차 항체를 사용하는 경우에만 적용됩니다.
7. 1x PBS로 빠르게 헹구고, 0.5% PBSTx로 구성된 1차 항체 용액 200μL를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그림 1에 표시된 1차 항체의 경우 Plexin-B1의 경우 1:200, Sox2의 경우 1:200, Tuj1, Myo6 및 Myo7A의 경우 각각 1:1,000 희석액을 사용합니다( 재료 목록 참조).
   참고: 모든 1차 항체는 항원결정기 결합 특성과 조직 샘플을 투과하는 능력에 따라 다르게 행동합니다.
8. 1차 항체 처리 후 PBSTx에서 4 x 30분 동안 헹구고 0.5% PBSTx(Materials List)로 구성된 2차 항체 용액 200μL를 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
   참고: 때로는 원치 않는 침전물을 펠릿화하기 위해 4°C에서 30분 동안 최고 속도로 2차 항체 용액을 회전시키는 것이 도움이 될 수 있습니다. 2차 용액이 원심분리된 경우 피펫 팁으로 튜브 바닥을 만지지 마십시오.
9. PBSTx에서 4 x 30분 동안 헹구고(또는 밤새 헹궈낸 다음) 광표백을 방지하는 데 도움이 되는 장착 매체(예: Fluoromount)를 사용하여 슬라이드를 장착합니다.
10. 이미징 설정에 적합한 두께의 적절한 크기의 커버슬립을 추가합니다(예: 두께가 0.13-0.16mm인 1번 커버슬립).

결과

우리는 자체 실험실에서 배아 16.5일(E16.5) 마우스 달팽이관의 정점 및 기저 회전과 출생 후 0일(P0) 및 P30 달팽이관의 기저 회전에 대한 예를 제시합니다. 이 샘플은 유모 세포(Myo7A 및 Myo6), 나선형 신경절 뉴런(SGN; Tuj1), 신경교세포(glia and support cells, Sox2), 그리고 달팽이관 주위의 기저막과 SGN을 표시하는 Plexin-B1. 서로 다른 발달 단계에서 달팽이관의 단면은 달팽이관의 성숙?...

토론

성공적인 동결절편 및 면역 염색을 위한 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 달팽이관 조직을 적절하게 고정하는 것이 필수적이며, 고정 기간도 중요하며, 이는 항체에 따라 달라질 수 있습니다. 대부분의 항체는 PFA의 경우 45분과 같이 더 짧은 고정 시간에서 더 잘 작동하지만, 일부 표적 항원결정기는 하룻밤 동안의 고정을 견딜 수 있습니다. 당사의 경험에 비추어 볼 때, 45?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	BP151-500
PBS	Corning, Inc.	46-013-CM
EDTA	Sigma-Aldrich, LLC.	60-00-4
Sucrose	VWR International, Inc.	97061-432
Sodium azide	Amresco, Inc.	0639-250G
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714
Ethanol	Decon labs, Inc.	v1001
Dimethylbutane	Thermo Fisher Scientific, Inc.	19387-AP
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	VWR International, Inc.	25608-930
Specific equipment
Cryostat	Thermo Fisher Scientific, Inc.	14-071-459
Disection forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
Hydrophobic Barrier Peroxidase-Antiperoxidase Pen (PAP)	Vector Laboratories, Inc.	H-4000
Confocal Microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC.	LSM 880
P20 micropipette	Gilson, Inc.	F144056M
Dissection scissors	Thermo Fisher Scientific, Inc.	08-951-20
Sylgard dish	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Mounting Materials
Fluoromount	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Superfrost plus slides	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1255015
Immunostaining Reagents
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch, Inc.	017-000-121
Anti-mouse FAB fragments	Jackson ImmunoResearch, Inc.	715-007-003
BlokHen	Aves labs, Inc.	BH-1001
Tuj1 (beta-III-tubulin) mouse monoclonal antibody	Biolegend, Inc.	MMS-435P
Sox2 goat polyclonal antibody	R&D Systems, Inc.	AF2018
Myo6 rabbit polyclonal antibody	Proteus Biosciences	25–6791
Myo7A rabbit polyclonal antibody	Thermo Fisher Scientific, Inc.	PA1-936
Plexin-B1 goat polyclonal antibody	R&D Systems, Inc.	AF3749
Secondary antibodies (made in donkey; Alexa-488, Cy3, Cy5)	Jackson ImmunoResearch, Inc.	see catalog