Kryosektion und Immunfärbung von Innenohrgewebe von Mäusen: vom Embryonalstadium bis zum Erwachsenenstadium

Zusammenfassung

Dieses Protokoll, das für unerfahrene Benutzer von Maus-Innenohrgewebe gedacht ist, beschreibt umfassend die Schritte zur Verarbeitung von Maus-Innenohren in verschiedenen Entwicklungsstadien für die Schnittimmunfärbung.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt allgemeine histologische Methoden zur Vorbereitung von Innenohrproben von embryonalen, neonatalen und adulten Mäusen. Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, Forschern, die möglicherweise neu auf diesem Gebiet sind und an der Arbeit mit der Cochlea der Maus interessiert sind, eine unkomplizierte und standardisierte Methode für die Verarbeitung von Innenohrgewebe zur Verfügung zu stellen. Hier sind Protokolle für Dissektion, Fixierung, Einbettung, Kryosektion und Immunfärbung enthalten. Die Schnittimmunfärbung ist eine der besten Methoden, um einzelne Zellen im Kontext der gesamten Cochlea zu untersuchen.

Zu den wichtigsten Schritten gehören das Präparieren des Innenohrs vom Schädel weg, das Fixieren des Gewebes mit 4 % Paraformaldehyd, das Einbetten mit einer Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur, Kryosektionen und Immunfärbungen mit Antikörpern, die auf bestimmte Proteine abzielen, die von der Cochlea exprimiert werden.

In unseren Methoden sind besondere Überlegungen für die Cochlea enthalten, da sie
Form und Struktur. Eine einigermaßen gute Fokussierung und Dissektionsfähigkeit sind erforderlich, da Gewebeschäden die Qualität der Immunfärbung und die Konsistenz zwischen den Proben beeinträchtigen können. Mit den von uns beschriebenen Verfahren können die meisten Benutzer jedoch in wenigen Wochen geschult werden, um schöne Vorbereitungen zu treffen. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine wertvolle Möglichkeit, die Forschung zum Verständnis der auditiven Entwicklung, Funktion und Krankheit in Mausmodellen zu fördern.

Einleitung

Das Verständnis der auditiven Entwicklung und Funktion ist entscheidend für die Charakterisierung und Behandlung verschiedener Formen von Hörverlust. Die Risikofaktoren für Hörverlust sind vielfältig und umfassen Diabetes ^1,2, Bluthochdruck ^3,4,5, Autoimmunerkrankungen ^6,7, bakterielle Meningitis ^8,9 und verschiedene neurodegenerative Erkrankungen 10,11,12,13 . Darüber hinaus können sich bestimmte Medikamente, wie z. B. einige Antibiotika und Chemotherapeutika, negativ auf das Gehör auswirken¹⁴. Abgesehen von den unmittelbaren Herausforderungen der Hörbehinderung kann sich ein Hörverlust negativ auf die kognitiven Funktionen auswirken und Angstzustände und Stress verstärken, was mit kognitiven Beeinträchtigungen und einer Verschlechterung der psychischen Gesundheit korrelieren kann 11,15,16. Mit der Veröffentlichung dieses Protokolls wollen wir alle Barrieren für den Einstieg in die Hörforschung abbauen, insbesondere für diejenigen, die noch keine Erfahrung mit der Cochlea haben. In diesem Leitfaden wird erläutert, wie Innenohrproben von embryonalen, juvenilen (neonatalen) und adulten Mäusen vorbereitet werden. Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, einen einfachen Ansatz für die Verarbeitung von Innenohrgewebe zu bieten und die Reproduzierbarkeit und Konsistenz über alle Experimente hinweg zu gewährleisten. Die Schnittimmunfärbung ist eine der besten Methoden, um verschiedene Zelltypen im Kontext der gesamten Cochlea zu untersuchen. Unter anderen Umständen kann die Immunfärbung mit ganzen Mounts vorteilhafter sein (z. B. die Untersuchung der Stereozilienmorphologie der Haarzellen oder der Proteinlokalisation).

Der Grund dafür sind die Herausforderungen bei der Arbeit mit der Cochlea der Maus. Seine geringe Größe, seine einzigartige Spirale und seine filigrane Struktur¹⁷ erfordern spezielle Techniken für die genaue Dissektion, Fixierung, Einbettung, Kryosektion und Immunfärbung. Die spiralförmige Form der Cochlea bedeutet, dass beim Einbetten sorgfältig auf die Ausrichtung geachtet werden muss, um sicherzustellen, dass jede Windung der Cochlea erhalten bleibt, was für das Erhalten konsistenter Schnitte entscheidend ist. Darüber hinaus erfährt die Cochlea mit zunehmender Reife eine Ossifikation¹⁸, was bedeutet, dass sie sich allmählich in Knochen verwandelt, was den Erhalt des Gewebes erschweren und eine Entkalkung erforderlich machen kann. Die Kryosektion-Immunfärbung bietet mehrere Vorteile gegenüber alternativen Präparaten (z. B. Ganz-Mount-Immunfärbung). Die Hauptvorteile der Kryosektion sind die allgemeine Konservierung von Proteinen und Nukleinsäuren, und die relativ dünnen ~2D-Schnitte ermöglichen konsistente und präzise Messungen. Darüber hinaus ermöglicht es die Konservierung und Visualisierung aller Cochlea-Zelltypen und kann die Qualität der Immunfärbung verbessern. Im Gegensatz zu vielen Cochlea-Ganzbettpräparaten bleiben bei der Kryosektion Strukturen wie das Spiralband, die Stria vascularis, die Reissner-Membran und die Tektorialmembran erhalten. In den folgenden früheren Veröffentlichungen finden Sie Beispiele für qualitativ hochwertige Immunfärbungen von embryonalen 19,20,21, neonatalen 22,23,24 und adulten^25,26 Innenohren.

Protokoll

HINWEIS: Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Georgetown University genehmigt. Alle Mäuse in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit dem Georgetown University Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll #1147) gehalten. In der ersten postnatalen Woche ist eine Entkalkung nicht erforderlich, da die Schläfenknochenstrukturen noch nicht vollständig entwickelt sind. Cochleae von Mäusen im Alter von P6 und älter erfordern jedoch eine Entkalkung und eine andere Methode der Dissektion. In unserem Protokoll wurden männliche und weibliche NCI Cr:NIH(S) (NIH Swiss) Mäuse und bei E16,5, P0 und P30 verwendet. Für jeden Abschnitt vermerken wir in Klammern, wie lange jeder Schritt für Anfänger voraussichtlich dauern wird. Viele der Schritte werden mit der Übung schneller.

1. Entnahme von embryonalen und juvenilen Innenohrproben (~75 min)

1. Einschläferung und Enthauptung von Mäusen gemäß einem genehmigten Tierversuchsprotokoll.
2. Machen Sie mit einer feinen Präparierschere vorsichtig einen Mittelschnitt entlang der Kopfhaut, beginnend am Hals bis zur Schnauze, und schieben Sie die Haut seitlich (erster Schnitt).
3. Platzieren Sie die untere Scherenklinge am Foramen magnum und die obere Scherenklinge am Schädel. Schneiden Sie die obere Hälfte des Schädels bis zur Nase ab (zweiter Schnitt).
4. Ziehen Sie die Schere aus dem teilweise eingeschnittenen Kopf heraus, platzieren Sie dann die untere Scherenklinge am unteren Ende des Schädels und die obere Schere enden am Foramen magnum. Schneide die untere Hälfte des Kopfes bis zur Nase ab (dritter Schnitt).
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Scherenklingen direkt durch die Mittellinie schneiden und mit wenig Kraftaufwand leicht schneiden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Scherenklingen genau zwischen dem linken und rechten Innenohr schneiden.
5. An dieser Stelle ist der Mäusekopf entlang der rostral-kaudalen Achse in zwei Hälften geteilt. Löse mit einer feinen Pinzette und einer Schere vorsichtig das Weichgewebe, das das Schläfenbein umgibt, wie Gehirn, Muskeln und Bindegewebe. Vermeiden Sie es, den Knochen oder die umliegenden Strukturen zu beschädigen.
6. Platzieren Sie die Halbköpfe der Maus in Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 1x PBS bei Raumtemperatur. Sobald jeder Kopf verarbeitet wurde, tauschen Sie die 1x PBS-Lösung gegen eine 4%ige PFA-Lösung (zur Fixierung) aus und inkubieren Sie sie 45 Minuten lang bei Raumtemperatur (typischerweise 20 °C).
   HINWEIS: Die Fixierungszeit kann je nach den Proteinen, die nachgewiesen werden müssen, und/oder der Bindungswirkung verschiedener Antikörper variieren.
7. Nach 45 min spülen Sie das Tuch 3 x 5-10 min mit 1x PBS aus.
8. Lagern Sie die Proben in 1x PBS bei 4 °C oder gehen Sie zum nächsten Schritt und zerlegen Sie sie. Für die Langzeitlagerung in 1x PBS mit 0,1 % Natriumazid bei 4 °C lagern.
9. Entsorgen Sie restliches Mausgewebe gemäß den Richtlinien der Einrichtung für die Entsorgung von biologischer Gefahr/Gewebe.

2. Embryonale und juvenile Innenohrprobendissektion (3 - 5 Minuten pro Probe)

1. Lokalisieren Sie das Schläfenbein/die Innenohrkapsel im Halbkopf der Maus. Es nimmt die gleiche Position wie das Außenohr ein, befindet sich aber im Inneren des Schädelknochens. Lösen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig das Weichgewebe, das die Innenohrkapsel umgibt. Sobald die Innenohrkapsel gelöst ist, beginnen Sie, das Gewebe um die Innenohrkapsel herum zu schneiden.
2. Ist die Innenohrkapsel weitestgehend vom Schädelgewebe befreit, üben Sie mit einer Pinzette sanft Druck auf die Umgebung der Innenohrkapsel aus, um sie vollständig zu befreien.
   HINWEIS: Üben Sie allmählichen Druck aus, um die Innenohrkapsel von den umgebenden Befestigungen zu lösen. Vermeiden Sie eine Beschädigung der Innenohrkapsel. Da das sich früh entwickelnde Innenohr ziemlich weich ist, vermeiden Sie den direkten Kontakt mit Ihrer Pinzette.
3. Lagern Sie die Innenohrproben wie in Schritt 1.8 und entsorgen Sie alle Rückstände aus dem fixierten Kopfgewebe.

3. Entnahme und Dissektion von Innenohrproben für Erwachsene (~75 min + 2 - 3 Tage EDTA-Behandlung)

1. Einschläferung und Enthauptung von Mäusen gemäß einem genehmigten Tierversuchsprotokoll.
2. Machen Sie mit einer scharfen Präparierschere vorsichtig einen Mittelschnitt entlang der Kopfhaut, beginnend am Hals und bis zur Schnauze. Falten Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen (erster Schnitt).
3. Platzieren Sie die untere Scherenklinge am Foramen magnum und die obere Scherenklinge am Schädel. Schneiden Sie die obere Hälfte des Schädels bis zur Nase ab (zweiter Schnitt).
   HINWEIS: Während dieses Schritts werden Sie ein mäßiges "Knirschen" der Scherenklingen bemerken; Das ist normal.
4. Ziehen Sie die Schere aus dem teilweise eingeschnittenen Kopf heraus, dann legen Sie die untere Scherenklinge an die Unterseite des Schädels und die obere Scherenklinge an das Foramen magnum. Schneide die untere Hälfte des Kopfes bis zur Nase (dritter Schnitt) und achte darauf, dass du genau an der Mittellinie entlang gehst, damit die Klingen die Innenohren nicht verpassen.
   HINWEIS: Schieben Sie die Schere nicht durch das Taschentuch; Dies könnte darauf hindeuten, dass die Klingen auf eines der Innenohren treffen.
5. Lösen Sie für jeden halben Kopf mit einer Pinzette und einer Schere sämtliches Weichgewebe, das das Schläfenbein umgibt, wie z. B. Gehirn, Muskeln und Bindegewebe.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um das Schläfenbein oder die umgebenden Strukturen nicht zu beschädigen.
6. Wenn das umgebende Gewebe befreit ist, rollen Sie das Schädelgewebe mit den Fingern zurück und üben Sie mit dem Daumen sanft Druck auf die Unterseite des Schläfenbeins aus. Üben Sie allmählichen Druck aus, während Sie den Knochen von seinen umgebenden Ansätzen lösen.
   HINWEIS: Wenn Druck ausgeübt wird, trennt sich die Innenohrkapsel allmählich von den umgebenden Knochen des Schädels. Bei sanfter Manipulation sollte der Knochen relativ leicht herausspringen.
7. Sobald die Innenohrkapsel entfernt ist, spülen Sie sie mit 1x PBS aus.
8. Füllen Sie eine Schaumschale mit 4% PFA und legen Sie sie unter das Mikroskop. Lege ein einzelnes herausgesprungenes Innenohr in die Sylgard-Schale.
9. Untersuchen Sie das Innenohr auf anhaftende Weichteile oder Knochen und entfernen Sie diese vorsichtig.
10. Finde das ovale Fenster und entferne die Steigbügel vorsichtig mit einer Pinzette.
11. Finde das runde Fenster und stiche ein kleines Loch, um sicherzustellen, dass kein umliegendes Gewebe es verstopft.
12. Öffnen Sie mit einer feinen Pinzette ein kleines Loch in der Spitze. Spülen Sie die Cochlea mit einer P20-Pipette, die mit 4 % PFA gefüllt ist, um sie zu fixieren. Stellen Sie sich vor, dass Flüssigkeit (verdünntes Blut, Endolymphe/Perilymphe) aus dem ovalen Fenster austritt.
13. Legen Sie die fixierte Cochlea in eine 24-Well-Platte, die mit 4 % PFA gefüllt ist. Markieren Sie die Zeit. 30-60 min bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren (Wippe oder Nutator) inkubieren, dann die Probe 3 x 5-10 min mit 1x PBS-Lösung spülen.
14. Legen Sie das Tuch nach der letzten Spülung in 1,25 mM EDTA und lassen Sie es 2-3 Tage bei 4 °C schaukeln.
15. Entsorgen Sie das verbleibende Mausgewebe ordnungsgemäß gemäß den Richtlinien der Einrichtung für die Entsorgung biologischer Gefahren/Gewebe.
16. Nach der EDTA-Behandlung spülen Sie das Tuch 3 x 5 min mit 1x PBS aus.
17. Lagern Sie die Proben in 1x PBS bei 4 °C oder gehen Sie zum nächsten Schritt und zerlegen Sie sie. Für die Langzeitlagerung lagern Sie die Proben in 1x PBS mit 0,1 % Natriumazid bei 4 °C.

4. Vorbereitung der Innenohrprobe für die Kryosektion (~24 h)

1. Legen Sie die präparierte Innenohrkapsel in 10% Saccharose (in 1x PBS) und lassen Sie sie mindestens 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Wenn die Proben vollständig äquilibriert sind, sinken sie auf den Boden des Röhrchens.
2. Entsorgen Sie die 10%ige Saccharoselösung, fügen Sie 20% Saccharose in 1x PBS hinzu und lassen Sie weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Die 20%ige Saccharoselösung verwerfen, 30%ige Saccharose in 1x PBS zugeben und über Nacht bei 4 °C (Minimum) inkubieren.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann auf 2 Stunden verkürzt werden, aber eine Inkubation über Nacht liefert die besten Ergebnisse. Das Gewebe kann über einen längeren Zeitraum in einem beliebigen Prozentsatz von Saccharose belassen werden.
   1. Nehmen Sie die Hälfte der 30%igen Saccharoselösung heraus und füllen Sie den Raum mit der optimalen Schnitttemperatur (OCT). Mindestens 30 min und maximal 2 h schaukeln lassen.
      HINWEIS: Wenn Sie die Proben längere Zeit im OCT belassen, schrumpft das Gewebe.
4. Übertragen Sie die Proben in markierte Kryoformen, die mit OCT gefüllt sind.
5. Überprüfen Sie die Cochlea-Orientierung unter dem Mikroskop im eingebetteten Kryoblock. Bei "normalen" Cochlea-Querschnitten ist zu bestätigen, dass die konkave Seite des Innenohrs den Schmalseiten des Kryomolds zugewandt ist.
6. Geben Sie Trockeneis in einen kleinen Behälter und fügen Sie 5-10 mL Ethanol oder Dimethylbutan hinzu. Legen Sie die Kryoformen + OCT + Probe auf blubberndes Trockeneis, um den Block schnell einzufrieren.
7. Lagern Sie die Proben bei -80 °C.

5. Schneiden der Innenohren (~25 min pro Probe)

1. Bringen Sie die Kryoblöcke in die Kammer eines auf -20 °C vorgekühlten Kryostaten. Lassen Sie die Proben dort 30-60 min äquilibrieren.
2. Markieren Sie mit einem Bleistift die Seite des Kryoblocks, die der Cochlea-Position entspricht, um die richtige Ausrichtung für die Schnitte zu gewährleisten.
3. Geben Sie eine kleine Lache OCT in das Spannfutter und legen Sie den Kryoblock mit der breiten Seite (ohne Bleistiftmarkierung) nach unten darauf.
4. Legen Sie das Spannfutter + OCT + Probe in die gekühlte Kryostatkammer, so dass das OCT vollständig einfrieren kann. Legen Sie nach einigen Minuten das Spannfutter + die Probe auf den Futterhalter, wobei die Bleistiftmarkierung nach rechts oder links zeigt.
5. Schneiden Sie den Block ab, bis das Gewebe sichtbar ist (verwenden Sie 40 μm als Trimmeinstellung).
6. Sobald das Gewebe sichtbar ist, entnehmen Sie einen 12 μm großen Schnitt mit Objektträgern, die für die Kryosektion ausgelegt sind, und überprüfen Sie die Schnittstelle unter einem Mikroskop.
7. Wenn Sie sich Cochlea-Windungen nähern, ernten Sie 12-μm-Schnitte und überprüfen Sie die Position gelegentlich, bis Sie alle Windungen hinter sich haben.
   HINWEIS: Die Anzahl der Abschnitte pro Folie kann variieren, aber wir erhalten in der Regel 8-10 Abschnitte pro Folie und etwa 6 Folien pro Cochlea.
8. Lagern Sie die Objektträger bei -80 °C.

6. Schnitt Immunfärbung (~1 - 3 Tage)

1. Nehmen Sie die Objektträger aus dem -80 °C heißen Gefrierschrank und lassen Sie sie ca. 10 Min. an der Luft trocknen.
2. Beschriften Sie die Objektträger mit einem Bleistift mit den Antikörpern, die verwendet werden sollen.
3. Zeichnen Sie die Ränder mit einem hydrophoben Marker (z. B. Hydrophobic Barrier Peroxidase-Antiperoxidase Pen (PAP)) nach.
4. Rehydrieren Sie die Proben in 1x PBS für 5 min.
5. Entsorgen Sie das 1x PBS von den Objektträgern und geben Sie 1x PBS + 0,1 % Triton X-100 (0,1 % PBSTx) für 20 Minuten zu den Objektträgern, um es zu permeabilisieren.
6. Entfernen Sie 0,1 % PBSTx aus dem Objektträger und fügen Sie 200 μl der Blockierungslösung für eine 1-2-stündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu.
   HINWEIS: Das Blockieren ist ein entscheidender Schritt in Immunfärbetechniken wie Immunhistochemie und Immunfluoreszenz, wo es die unspezifische Bindung von Antikörpern an Gewebe oder Zellen verhindert. Weitere Informationen finden Sie in Lewis' Leitfaden zur Auswahl von Kontroll- und Blockierungsreagenzien²⁷. Eine häufig verwendete Blockierungslösung ist 10 % normales Eselserum in 0,5 % PBSTx, dies gilt jedoch nur, wenn sekundäre Antikörper aus Esel verwendet werden.
7. Spülen Sie kurz mit 1x PBS ab, fügen Sie 200 μl Primärantikörperlösung aus 0,5 % PBSTx hinzu und inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Für die in Abbildung 1 gezeigten Primärantikörper sind folgende Verdünnungen zu verwenden: 1:200 für Plexin-B1, 1:200 für Sox2, je 1:1.000 für Tuj1, Myo6 und Myo7A (siehe auch Materialliste).
   HINWEIS: Jeder Primärantikörper verhält sich unterschiedlich, abhängig von seinen Epitopbindungseigenschaften und seiner Fähigkeit, Gewebeproben zu durchdringen.
8. Nach der Behandlung mit Primärantikörpern 4 x 30 Minuten in PBSTx spülen, 200 μl Sekundärantikörperlösung aus 0,5 % PBSTx (Materialliste) zugeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Manchmal kann es hilfreich sein, sekundäre Antikörperlösungen 30 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit bei 4 °C zu schleudern, um unerwünschten Niederschlag zu pelletieren. Wenn die Sekundärlösungen zentrifugiert wurden, vermeiden Sie es, den Boden des Röhrchens mit der Pipettenspitze zu berühren.
9. Spülen Sie die Objektträger 4 x 30 Minuten lang in PBSTx (oder spülen Sie sie über Nacht) und montieren Sie sie dann mit einem Eindeckmedium, das Photobleaching verhindert (z. B. Fluoromount).
10. Fügen Sie ein Deckglas in geeigneter Größe mit einer Dicke hinzu, die für die Bildgebungseinrichtung geeignet ist (z. B. Deckgläser Nr. 1, die 0,13 bis 0,16 mm dick sind).

Ergebnisse

Wir präsentieren Beispiele aus unserem eigenen Labor der Apex- und Basaldrehung einer Maus-Cochlea am embryonalen Tag 16.5 (E16.5) und der Basaldrehung der Cochlea nach der Geburt Tag 0 (P0) und P30. Diese Proben wurden unter Verwendung von Markern für Haarzellen (Myo7A und Myo6), Spiralganglien-Neuronen (SGNs; Tuj1), Glia- und Stützzellen (Sox2) und Plexin-B1, das die Basalmembran um den Cochlea-Ductus und die SGNs markiert. Die Querschnitte der Cochlea in verschiedenen Entwicklungss...

Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte für eine erfolgreiche Kryosektion und Immunfärbung. Die richtige Fixierung des Cochlea-Gewebes ist unerlässlich, und auch die Dauer der Fixierung ist wichtig, die je nach Antikörper variieren kann. Während die meisten Antikörper mit einer kürzeren Fixierungszeit, wie z. B. 45 Minuten bei PFA, besser wirken, können einige Zielepitope eine Fixierung über Nacht tolerieren. Basierend auf unseren Erfahrungen gewährleistet eine 45-minütige Fixierung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	BP151-500
PBS	Corning, Inc.	46-013-CM
EDTA	Sigma-Aldrich, LLC.	60-00-4
Sucrose	VWR International, Inc.	97061-432
Sodium azide	Amresco, Inc.	0639-250G
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714
Ethanol	Decon labs, Inc.	v1001
Dimethylbutane	Thermo Fisher Scientific, Inc.	19387-AP
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	VWR International, Inc.	25608-930
Specific equipment
Cryostat	Thermo Fisher Scientific, Inc.	14-071-459
Disection forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
Hydrophobic Barrier Peroxidase-Antiperoxidase Pen (PAP)	Vector Laboratories, Inc.	H-4000
Confocal Microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC.	LSM 880
P20 micropipette	Gilson, Inc.	F144056M
Dissection scissors	Thermo Fisher Scientific, Inc.	08-951-20
Sylgard dish	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Mounting Materials
Fluoromount	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Superfrost plus slides	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1255015
Immunostaining Reagents
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch, Inc.	017-000-121
Anti-mouse FAB fragments	Jackson ImmunoResearch, Inc.	715-007-003
BlokHen	Aves labs, Inc.	BH-1001
Tuj1 (beta-III-tubulin) mouse monoclonal antibody	Biolegend, Inc.	MMS-435P
Sox2 goat polyclonal antibody	R&D Systems, Inc.	AF2018
Myo6 rabbit polyclonal antibody	Proteus Biosciences	25–6791
Myo7A rabbit polyclonal antibody	Thermo Fisher Scientific, Inc.	PA1-936
Plexin-B1 goat polyclonal antibody	R&D Systems, Inc.	AF3749
Secondary antibodies (made in donkey; Alexa-488, Cy3, Cy5)	Jackson ImmunoResearch, Inc.	see catalog