Un método para el 2-Photon imágenes del flujo sanguíneo en la neocorteza a través de una ventana craneal

Resumen

Cortical dinámica del flujo de sangre se pueden estudiar en vivo por la proyección de imagen fluorescente tintes dextrano se inyecta en la vena de la cola de los roedores con dos fotones microscopía. Este vídeo muestra cómo la dinámica de la imagen del flujo sanguíneo en la corteza cerebral de los ratones a través de una cubierta de vidrio preparación ventana craneal.

Resumen

La capacidad de la imagen de la vasculatura cerebral (desde los grandes buques a los capilares) y la dinámica de registro de flujo sanguíneo en el cerebro intacto de los roedores que viven es una poderosa técnica. El uso en vivo de 2 fotones microscopía través de una ventana craneal es posible tintes fluorescentes imagen inyecta por vía intravenosa. Esto le permite a uno la imagen de la vasculatura cortical y también para obtener mediciones del flujo sanguíneo. Esta técnica fue desarrollada originalmente por David Kleinfeld y Winfried Denk. El método puede ser usado para estudiar la dinámica del flujo sanguíneo durante o después de la isquemia cerebral, en las enfermedades neurodegenerativas, en los tumores de cerebro, o en la fisiología normal del cerebro. Por ejemplo, se ha utilizado para estudiar cómo se produce movimiento en la dirección de los cambios del flujo sanguíneo y cambios en la velocidad de los glóbulos rojos o de flujo en y alrededor del infarto. Aquí se demuestra cómo utilizar dos fotones microscopía a la dinámica de la imagen del flujo sanguíneo en la corteza cerebral de ratones vivos utilizando colorantes fluorescentes se inyecta en la vena de la cola.

Protocolo

Inyecciones de vena de la cola de los tintes fluorescentes dextranos

1. Con el fin de la vasculatura cerebral imagen, los animales deben ser inyectadas por vía intravenosa con un tinte fluorescente. Usamos dextrano conjugado con tintes porque la fracción de dextrano impide que el tinte de cruzar la barrera sangre-cerebro y la fuga de los vasos sanguíneos.
2. Los ratones son anestesiados con isoflurano (4% para la inducción, 1,5-2% durante la inyección).
3. La cola es desinfectada con alcohol al 70%.
4. Con una aguja de calibre 26, 75-100 l de un 5% v / v de rodamina dextrano disuelto en solución salina se inyecta a través de la vena de la cola, a medio camino a lo largo del eje de la cola.
5. Los animales pueden ser reflejados inmediatamente después de la inyección vena de la cola hasta que el colorante se excreta en la orina, que se vuelven de color rosa si se utiliza un colorante rodamina en alrededor de 2 horas.

Imágenes del flujo sanguíneo utilizando microscopía de dos fotones (la duración total de 30-60 minutos por sesión, dependiendo del número de buques de imágenes)

1. Después de la inyección de dextrano tinte fluorescente, el ratón es anestesiados con isoflurano (4% para la inducción, 1-1.5% de imagen).
2. Ratón está bien conectado con la barra de titanio a la platina del microscopio, que contiene una almohadilla térmica termo-regulado para mantener al animal caliente. Algunos ungüento oftálmico se aplica para mantener los ojos húmedos.
3. La cubierta de vidrio de la ventana del cráneo se limpia con alcohol al 70%.
4. La ventana se coloca paralela al plano focal y se centra en el campo de visión en el objetivo de 4X.
5. Lo mejor es tomar una fotografía de los vasos cerebrales superficie con una cámara digital. Esta imagen se utilizará como imagen de referencia en las siguientes sesiones de formación de imágenes para encontrar la zona visualizada en repetidas ocasiones el día a día.
6. El objetivo de 4X se reemplaza con el objetivo de inmersión en agua 40 veces sin mover el escenario. Una fotografía digital del campo de visión es tomada de nuevo. Las coordenadas en el manipulador de la etapa se fija en cero.
7. Usamos scanimage como el software de adquisición de imágenes. Esto fue escrito en Matlab Tom Pologruto y Bernardo Sabatini en el laboratorio de Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003). Pasamos a continuación a todos los otros equipos: el láser, el medidor de potencia, los tubos foto multiplicadores, los amplificadores, etc
8. El área de la ventana adecuada para obtener imágenes digitalizadas es brevemente a bajo aumento para encontrar las mejores regiones. Una vez que estos se identifican, una pila de bajo aumento de la región elegida para la imagen está tomada, y sus coordenadas XY se anotan.
9. Para grabar la dinámica del flujo sanguíneo en los vasos pequeños o capilares que usamos líneas de barrido a lo largo de por lo menos 40 m de la embarcación de interés. Estos solo "barrido" que dura un segundo se realizan utilizando la potencia del láser como poco como sea posible y las coordenadas y el ángulo de exploración están escritas.
10. Una vez que la sesión de imágenes es más, el animal se mueve a una cámara de calentamiento en los que puede recuperarse de la anestesia.

Discusión

Cortical dinámica del flujo de sangre se pueden estudiar en vivo por la proyección de imagen fluorescente tintes dextrano se inyecta en la vena de la cola de los roedores con microscopia de dos fotones. Este video muestra un método para saber cómo la dinámica de la imagen del flujo sanguíneo en la corteza cerebral de los ratones a través de una cubierta de vidrio preparación ventana craneal.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescein isothio-cyanate-dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	FD500S	mol wt 500,000
Rhodamine B isothio-cyanate-dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	R9379	mol wt ~70,000