Метод 2-Фотон изображений кровотока в коре головного мозга через черепной Window

Резюме

Корковая динамика кровотока могут быть изучены в естественных условиях при визуализации флуоресцентных красителей декстрана вводят в хвостовую вену грызунов с 2-фотонной микроскопии. Это видео показывает, как изображение кровотока динамика в коре головного мозга мышей через застекленные окна черепных подготовки.

Аннотация

Способность изображения мозговой сосудистой (из крупных сосудов в капилляры) и записывать динамику кровотока в интактном мозге жизни грызунов мощная техника. Использование в естественных условиях 2-фотонной микроскопии через черепную окна можно изображений флуоресцентных красителей вводят внутривенно. Это позволяет, чтобы изображение коры сосудистую, а также для получения измерений кровотока. Эта методика была разработана Дэвидом Кляйнфельд и Винфрид Денк. Метод может быть использован для изучения динамики кровотока во время или после ишемии головного мозга, при нейродегенеративных расстройствах, при опухолях головного мозга, или в нормальной физиологии мозга. Например, он был использован для изучения того, как инсульт вызывает сдвиги в крови направления потока и изменения в красных кровяных телец скорости или потока внутри и вокруг инфаркта. Здесь показано, как использовать 2-фотонной микроскопии для изображения динамики кровотока в коре головного мозга жизни мышей использованием флуоресцентных красителей вводят в хвостовую вену.

протокол

Хвостовую вену инъекции флуоресцентных красителей декстраны

1. Для того, чтобы изображение мозговой сосудистой сети, животные должны быть введены внутривенно с флуоресцентным красителем. Мы используем декстран-сопряженных красители, потому что часть декстран предотвращает краситель пересечь барьер мозга крови и утечки из кровеносных сосудов.
2. Мыши анестезировали изофлуран (4% для индукции, 1,5-2% в течение инъекции).
3. Хвост дезинфицируют 70% спиртом.
4. С 26 иглы, 75-100 мкл 5% объем / объем раствора родамина декстран растворенный в физиологическом растворе вводится через хвостовую вену, на полпути вдоль вала хвоста.
5. Животные могут быть отображены сразу же после инъекции вены хвоста, пока краситель выделяется с мочой, которые становятся розовыми, если используется краситель родамин около 2 часов.

Визуализация кровотока с помощью двух-фотонной микроскопии (общая продолжительность 30-60 мин за сеанс, в зависимости от количества судов отображаемого)

1. После инъекции флуоресцентного красителя декстран, мышь под наркозом с изофлуран (4% для индукции, 1-1,5% для работы с изображениями).
2. Мышь прочно прикреплены использованием титана бар столик микроскопа, который содержит термо-регулируемых грелку держать животное тепло. Некоторые глазная мазь применяется сохранить глаза влажными.
3. Покровного стекла черепной окно очищается 70% спиртом.
4. Окна расположены параллельно фокальной плоскости и в центре поля зрения под 4X цели.
5. Лучше всего, чтобы сфотографировать поверхность сосудов головного мозга с помощью цифрового фотоаппарата. Эта картина будет использоваться в качестве образа ссылки в следующих изображений сессий, чтобы найти отображаемого региона неоднократно изо дня в день.
6. 4X цель заменяется на погружение в воду 40X цели, не двигаясь стадии. Цифровое изображение поля зрения берется снова. Координат на этапе манипулятора установлены на нулевом уровне.
7. Мы используем ScanImage как приобретение программного обеспечения изображения. Это было написано в MatLab Томом Pologruto и Бернардо Сабатини в лаборатории Карел Свобода (Pologruto и соавт., 2003). Теперь мы переходим на все другое оборудование: лазерная, измеритель мощности, фото мультипликаторы трубы, усилители и т.д.
8. Области окна, подходящие для включения в образ кратко отсканированы при малом увеличении найти лучших регионов. Как только они определили, низкий стек увеличение выбранной области изображения, чтобы берется, и его XY координаты комментариями.
9. Для записи динамику кровотока в мелких сосудах или капилляры мы используем линии сканирования по крайней мере 40 мкм судна интересов. Эти одиночные "зачисток" прочное одну секунду делается с использованием в качестве маленькой мощности лазера в качестве возможной и координаты и угол сканирования записаны.
10. После визуализации сессия закончилась, животное перемещается в теплой камере, где он может оправиться от наркоза.

Обсуждение

Корковая динамика кровотока могут быть изучены в естественных условиях при визуализации флуоресцентных красителей декстрана вводят в хвостовую вену грызунов с двухфотонной микроскопии. Это видео показали метод для того, как изображение кровотока динамика в коре головного мозга мышей через зас...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescein isothio-cyanate-dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	FD500S	mol wt 500,000
Rhodamine B isothio-cyanate-dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	R9379	mol wt ~70,000