שיטה הדמיה 2-פוטון של זרימת הדם הניאוקורטקס דרך חלון גולגולתי

Summary

קליפתיים זרימת הדם דינמיקה ניתן ללמוד in vivo על ידי הדמיה צבעי ניאון dextran מוזרק לווריד הזנב של מכרסמים עם מיקרוסקופיה 2-פוטון. סרט הווידאו הזה מראה כיצד דם תמונה הדינמיקה לזרום הניאוקורטקס של עכברים באמצעות הכנה זכוכית מכוסה, חלון גולגולתי.

Abstract

היכולת התמונה בכלי הדם המוחיים (מכלי גדול נימי דם) ודם שיא הדינמיקה לזרום במוח שלם של מכרסמים החיים היא טכניקה רבת עוצמה. שימוש in vivo 2-פוטון מיקרוסקופית דרך חלון גולגולתי אפשר צבעי ניאון תמונה מוזרק לווריד. זה מאפשר אחד התמונה vasculature קורטיקליים וגם להשיג מדידות של זרימת הדם. טכניקה זו פותחה במקור על ידי דוד קליינפלד ואת Winfried Denk. השיטה יכולה לשמש ללמוד זרימת הדם דינמיקה במהלך או לאחר איסכמיה מוחית, הפרעות ניווניות, גידולים במוח, או בפיזיולוגיה של המוח נורמלי. כך, למשל, נעשה שימוש כדי ללמוד כיצד גורמת לשבץ במשמרות בכיוון זרימת הדם ואת השינויים מהירות תא דם אדום או שטף באזור האוטם. כאן אנו מדגימים כיצד להשתמש 2-פוטון מיקרוסקופית לדם לזרום הדינמיקה תמונה הניאוקורטקס של עכברים חיים באמצעות צבעי ניאון מוזרק לווריד הזנב.

Protocol

וריד הזנב זריקות של צבעי ניאון dextrans

1. כדי vasculature תמונה מוחין, בעלי חיים חייב להיות מוזרק לווריד עם פלורסנט לצבוע. אנו משתמשים ב-dextran מצומדות צובעת כי מחצית dextran מונע את צבען לעבור את מחסום הדם במוח דולף מתוך כלי הדם.
2. עכברים מורדמים עם isoflurane (4% לזירוז, 1.5-2% במהלך ההזרקה).
3. הזנב הוא לחטא עם אלכוהול 70%.
4. בעזרת מחט מד 26, 75-100 μl של פתרון v / v 5% rhodamine dextran מומס מלוחים מוזרק דרך וריד הזנב, באמצע הדרך לאורך הציר של הזנב.
5. בעלי חיים עשוי להיות צילמו מיד לאחר ההזרקה לווריד הזנב עד לצבוע מופרש בשתן, אשר יהפוך ורוד אם באמצעות צבע rhodamine בסביבות 2 שעות.

הדמיה של זרימת הדם באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה (משך סה"כ 30-60 דקות בכל הפעלה, בהתאם למספר כלי הדמיה)

1. בעקבות הזרקת צבע פלואורסצנטי dextran, העכבר הוא הרדים עם isoflurane (4% לזירוז, 1-1.5% עבור הדמיה).
2. העכבר מחובר היטב באמצעות סרגל טיטניום לשלב את המיקרוסקופ, אשר מכיל כרית תרמו מוסדר חימום כדי לשמור על בעלי החיים החם. משחה חלק העין מוחל לשמור על עיניים לחות.
3. הזכוכית המכסה של החלון גולגולתי הוא ניקה עם אלכוהול 70%.
4. החלון ממוקם במקביל למישור מוקדי מרוכז בתחום להציג תחת המטרה 4X.
5. מומלץ לצלם את כלי השטח המוח עם מצלמה דיגיטלית. תמונה זו תשמש כתמונת התייחסות הבאים הפעלות הדמיה כדי למצוא את האזור צילמו שוב ושוב מדי יום.
6. המטרה 4X מוחלפת במטרה טבילה במים 40X מבלי להזיז את הבמה. תמונה דיגיטלית של שדה הראייה הוא נלקח שוב. הקואורדינטות ב מניפולטור השלב נקבעים על אפס.
7. אנו משתמשים ScanImage כתוכנה רכישת התמונה. זה נכתב על ידי טום Pologruto Matlab ו ברנרדו סבטיני במעבדה של קארל סוובודה (Pologruto et al., 2003). אנחנו הבא להפעיל את כל הציוד אחרות: לייזר, מד הכוח, מכפילי צינורות צילום, מגברים ועוד
8. האזור של החלון מתאים להיות צילמו נסרק בקצרה בהגדלה נמוכה כדי למצוא את האזורים הטובים ביותר. פעם אלה מזוהים, ערימה הגדלה נמוכה של האזור שנבחר התמונה לקוחה, ומתאם XY שלה המבואר.
9. כדי להקליט זרימת הדם דינמיקה בכלי קטן או נימים אנו משתמשים סריקות לאורך קו לפחות 40 מיקרומטר של כלי השיט של עניין. אחד אלה "מטאטא" השני שנמשך אחד הן נעשה באמצעות ככוח לייזר קטן ככל האפשר את הקואורדינטות וזווית סריקה כתובים למטה.
10. לאחר הפגישה הדמיה נגמר, החיה מועברת לחדר חמים שבו הוא יכול להתאושש מן ההרדמה.

Discussion

קליפתיים זרימת הדם דינמיקה ניתן ללמוד in vivo על ידי הדמיה צבעי ניאון dextran מוזרק לווריד הזנב של מכרסמים עם מיקרוסקופ שני הפוטונים. וידאו זה הראה שיטה איך הדם תמונת הדינמיקה לזרום הניאוקורטקס של עכברים באמצעות הכנה זכוכית מכוסה, חלון גולגולתי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescein isothio-cyanate-dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	FD500S	mol wt 500,000
Rhodamine B isothio-cyanate-dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	R9379	mol wt ~70,000