Un metodo per 2-Photon Imaging del flusso sanguigno nella neocorteccia attraverso una finestra del cranio

Riepilogo

Corticale dinamiche di flusso di sangue possono essere studiati in vivo attraverso l'immagine fluorescente coloranti destrano iniettato nella vena della coda di roditori con 2-fotone microscopia. Questo video mostra come la dinamica del flusso ematico immagine in neocorteccia di topi attraverso un vetro coperto di preparazione finestra cranica.

Abstract

La possibilità di immagine del sistema vascolare cerebrale (da grandi recipienti di capillari) e registrare la dinamica del flusso sanguigno nel cervello dei roditori che vivono intatto è una tecnica potente. Utilizzando in vivo 2-fotone microscopia attraverso una finestra del cranio è possibile coloranti fluorescenti immagine iniettato per via endovenosa. Questo permette uno per l'immagine della vascolarizzazione corticale e anche per ottenere misurazioni del flusso sanguigno. Questa tecnica è stata originariamente sviluppata da David Kleinfeld e Winfried Denk. Il metodo può essere utilizzato per studiare la dinamica del flusso di sangue durante o dopo l'ischemia cerebrale, nei disordini neurodegenerative, in tumori cerebrali, o in fisiologia cerebrale normale. Per esempio, è stato utilizzato per studiare come ictus provoca cambiamenti nella direzione del flusso sanguigno e cambiamenti nella velocità dei globuli rossi o di flusso all'interno e intorno l'infarto. Qui mostriamo come utilizzare 2-fotone microscopia a dinamiche immagine del flusso sanguigno nella corteccia di topi vivi con coloranti fluorescenti iniettato nella vena della coda.

Protocollo

Vena iniezioni coda di coloranti fluorescenti destrani

1. Al fine di vascolarizzazione cerebrale immagine, gli animali devono essere iniettato per via endovenosa con un colorante fluorescente. Noi usiamo destrano coniugato coloranti perché la frazione destrano impedisce la tintura di attraversare la barriera ematoencefalica e la fuoriuscita dei vasi sanguigni.
2. I topi vengono anestetizzati con isoflurano (4% per l'induzione, 1,5-2% durante l'iniezione).
3. Coda è disinfettata con alcool al 70%.
4. Con un ago 26 gauge, 75-100 ml di un 5% v / v soluzione di rodamina destrano sciolto in soluzione salina viene iniettata attraverso la vena della coda, a metà strada lungo il fusto della coda.
5. Gli animali possono essere ripreso immediatamente dopo l'iniezione fino a quando la coda vena colorante è escreto nelle urine, che si tingono di rosa se si utilizza un colorante rodamina in circa 2 ore.

Imaging del flusso di sangue usando la microscopia a due fotoni (durata totale di 30-60 minuti per sessione, a seconda del numero di navi ripreso)

1. Dopo l'iniezione di destrano colorante fluorescente, il mouse è anestetizzato con isoflurano (4% per l'induzione, 1-1,5% per l'imaging).
2. Mouse è saldamente utilizzando la barra di titanio allo stadio microscopio, che contiene un termoregolato pad riscaldamento per mantenere l'animale caldo. Alcuni unguento oculare viene applicato a tenere gli occhi umidi.
3. La copertura in vetro della finestra cranica è pulito con alcool al 70%.
4. La finestra è posizionato parallelo al piano focale e centrato nel campo visivo nel quadro dell'obiettivo di 4X.
5. E 'meglio prendere una fotografia di navi di superficie del cervello con una fotocamera digitale. Questa immagine sarà utilizzata come immagine di riferimento nel seguire le sessioni di imaging per trovare la regione ripreso più volte da un giorno all'altro.
6. L'obiettivo 4X è sostituito con l'obiettivo 40X immersione in acqua senza spostare il palco. Una foto digitale del campo visivo è ripreso. Le coordinate del manipolatore stadio sono fissati a zero.
7. Noi usiamo scanimage come il software di acquisizione immagini. Questo è stato scritto in MatLab da Tom Pologruto e Bernardo Sabatini nel laboratorio di Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003). Abbiamo poi accendere tutte le altre apparecchiature: il laser, il misuratore di potenza, i tubi moltiplicatori foto, gli amplificatori, ecc
8. L'area della finestra adatte ad essere ripreso è brevemente scansione a basso ingrandimento per trovare la migliore regioni. Una volta che questi vengono identificati, uno stack basso ingrandimento della regione scelta per l'immagine è presa, e le sue coordinate XY sono annotati.
9. Per registrare la dinamica del flusso di sangue nei piccoli vasi o capillari usiamo scansioni linea lungo almeno 40 micron della nave di interesse. Queste singolo "spazza" della durata di un secondo sono fatto usando come potenza del laser meno possibile e le coordinate e l'angolo di scansione sono scritte.
10. Una volta che la sessione di imaging è finita, l'animale viene spostato in una camera calda dove si può recuperare l'anestesia.

Discussione

Corticale dinamiche di flusso di sangue possono essere studiati in vivo attraverso l'immagine fluorescente coloranti destrano iniettato nella vena della coda di roditori con la microscopia a due fotoni. Questo video ha mostrato un metodo per come la dinamica del flusso ematico immagine in neocorteccia di topi attraverso un vetro coperto di preparazione finestra cranica.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescein isothio-cyanate-dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	FD500S	mol wt 500,000
Rhodamine B isothio-cyanate-dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	R9379	mol wt ~70,000