Un ensayo de conducta para medir la capacidad de respuesta de pez cebra a cambios en la intensidad de luz

Resumen

Hemos desarrollado la respuesta de Visual-Motor para cuantificar la potencia del motor de larvas de pez cebra en respuesta a incrementos de la luz y disminuye. También se examinaron el pez cebra mutantes de visión, incluyendo la no respuesta optocinético (NRC) de los mutantes, lo que se pensaba que eran completamente ciegos cuando se probó por otro ensayo de la visión, el reflejo de optocinético.

Resumen

El reflejo de optocinético (okr) es un reflejo básico visual exhibida por la mayoría de los vertebrados y juega un papel importante en la estabilización de los ojos con respecto a la escena visual. Sin embargo, el okr requiere que el animal detecta franjas en movimiento y es posible que los peces que no presentan un okr no puede ser completamente ciego. Un pez cebra mutante, la c no optocinético respuesta (NRC) no tiene okr bajo cualquier condición de iluminación a prueba y se informó a ser completamente ciego. Anteriormente, hemos demostrado que fuera de actividad de las células ganglionares se pueden grabar en estos mutantes. Para determinar si los peces mutantes sin okr como el mutante NRC puede detectar incrementos y decrementos de luz simples, hemos desarrollado el análisis visual del comportamiento motor (VMR). En este ensayo, larvas de pez cebra solo se colocan en cada pocillo de una placa de 96 pocillos que permite el control simultáneo de las larvas utilizando un sistema automatizado de vídeo-seguimiento del sistema. Las respuestas del aparato locomotor de cada larva a 30 minutos de luz ON y 30 minutos de luz fueron grabados y cuantificados. PESO peces tienen un breve repunte de la actividad motora en las luces, conocida como la respuesta de sobresalto, seguido por el retorno a la menor a la actividad de referencia, llamado el congelamiento. PESO pescado también aumentar bruscamente su actividad locomotora inmediatamente después de luces apagadas y sólo gradualmente (durante varios minutos) volver a la actividad basal del aparato locomotor. Los mutantes NRC responden de manera similar a la luz OFF como el pescado WT, pero presentan una ligera reducción en su actividad promedio en comparación con los peces WT. La actividad motora en respuesta a la luz el NRC en los mutantes se ha retrasado y lento. Hay un tiempo lento aumento de la respuesta de la NRC mutante a la luz en comparación con la luz PESO EN respuesta. Los resultados indican que los peces NRC no son completamente ciegos. Debido a que los teleósteos pueden detectar la luz a través de la retina no-tejidos, que confirmó que las respuestas inmediatas del comportamiento de los cambios de intensidad de luz requieren los ojos intactos con la chokh (chk) mutantes que carecen por completo de los ojos desde las primeras etapas de desarrollo. En nuestro ensayo VMR, los mutantes chk no presentan respuesta de sobresalto a la luz ya sea encendido o apagado, que muestran que los ojos laterales mediar en este comportamiento. El ensayo se describe aquí VMR complementa el ensayo okr bien establecida, que no pone a prueba la capacidad de las larvas de pez cebra para responder a los cambios en la intensidad de la luz. Además, la automatización del ensayo VMR se presta a la selección de alto rendimiento de los defectos de intensidad de la luz impulsado por las respuestas visuales.

Protocolo

Este protocolo describe los pasos para llevar a cabo la respuesta de Visual-Motor de larvas de pez cebra a los incrementos y decrementos de la luz en su propio laboratorio. Pez cebra son un modelo ideal para estudios de comportamiento. Son fáciles de mantener, tienen gran tamaño del embrague, y se desarrollan rápidamente. Por ejemplo, los ojos de las larvas de pez cebra son sensibles a la luz el día 3 de desarrollo y de momento en el que muestran una respuesta de sobresalto.

Parte 1: Revestimiento de cada pez en una placa de 96 pocillos

1. Crecen las larvas PESO bajo un ciclo luz / oscuridad a 28 ° C hasta por lo menos 4 días después de la fertilización (dpf). Nuestra típica luz: oscuridad ciclo es de 14 horas de las luces en partir de las 9:00 AM, y 10 horas de las luces apagadas, a partir de las 11:00 PM. Para obtener los mejores resultados de comportamiento, evitar el hacinamiento, que suelen mantener no más de 50 larvas en una sola placa de Petri.
2. Después de 4 dpf, el pez cebra está listo para ser transferido a una placa de 96 pocillos. Para dar más espacio a las larvas de natación, que suelen utilizar una placa de 96 pocillos con un amplio y tamaño de 650 l, sin embargo, el estándar de 96 placas de funcionar bien. Usando una pipeta de plástico, con cuidado de transferencia de una larva por cada pozo.
3. Después de transferir los peces en los pozos, llene cada pozo con peces de agua suficiente como para que la superficie del agua está casi al ras de la parte superior de los pozos. Ya sea el sobrellenado o llenado insuficiente del bien pueden causar problemas ópticos para la grabación de la cámara. Además, tenga cuidado de no introducir burbujas en los pocillos.

Parte 2: Estudio de los aparatos de grabación

Para esta parte del protocolo, por favor refiérase a la película para identificar los componentes y para familiarizarse con nuestra puesta en marcha de los aparatos de grabación.

1. Dentro de la cámara de grabación es un lugar bien definido en la posición de la placa de 96 pocillos.
2. La cámara se coloca en la espalda y se centra en la placa usando los espejos de la caja. El ángulo de los espejos puede ajustarse girando los tornillos que sujetan los espejos en su lugar.
3. La cámara de grabación se ilumina desde la parte inferior por LEDs infrarrojos. Esto permite a la cámara para ver a los peces, incluso en la oscuridad. Las larvas no pueden detectar la luz infrarroja, por lo que esta constante iluminación de infrarrojos no afecta a la experiencia. LED blancos también iluminar la cámara de registro desde abajo. Que se controlan por separado de las luces de IR. Iluminación de la cámara con luz blanca desde arriba o desde los lados es ciertamente posible, sin embargo, en esos casos, se debe tener cuidado para evitar una fuerte mira la superficie del agua que pueden interferir con la cámara.
4. Para los experimentos que duran más de un par de horas, llenar la cámara con suavemente con agua corriente para ayudar a mantener una temperatura constante durante el tiempo experimental. Una forma de lograr un flujo constante de agua para bombear agua de un depósito por una pequeña bomba de acuario que se calienta a 28 ° con un calentador de acuario submarino típico.
5. Para minimizar la vibración se apartan de la habitación, la unidad de grabación de todo debe sentarse sobre una mesa balance pesado.

Parte 3: Alineación de la placa de 96 pozos con la red informática de la vídeo-seguimiento

Software

1. Coloque la placa de 96 pocillos que contienen el pescado en la cámara de grabación.
2. Cuando se utiliza un baño de agua, lentamente, se coloca la placa en el agua, lo que el nivel del agua la oportunidad de adaptarse sin derramar en el plato. Por otra parte, cerrar el flujo de agua, añadir el plato, y luego reanudar el flujo. Además, asegúrese de usar un resorte o una banda elástica para sujetar la placa de 96 pozos en el lugar.
3. En el software de VideoTrack punto de vista, comprobar que todas las larvas de su experimento son visibles en la pantalla del ordenador. Uso de los controles del software, alinear la red del software de vídeo-seguimiento de los pozos de la placa de tal manera que cada pez se encuentra dentro de una plaza de la parrilla. El equipo de seguimiento será el cálculo de los movimientos por separado para cada una de estas cajas, por lo que si desalinear la red de computadora algunos de los movimientos de los peces se pueden perder. O peor aún: dos peces adyacentes ocupan la misma área y ser contado como un pez. Este paso es muy importante para todas sus grabaciones.
4. Después de la alineación, el programa de tiempo para cuando las luces se encienden y se apagan. Por lo general permite 3 horas de adaptación a la luz o la oscuridad en el cuadro, tanto para obtener un nivel de actividad de referencia, sino también para dar las larvas de una oportunidad para calmarse después de la pipeta y la manipulación. Después de la línea de base, que luego alterna con 30 minutos de las luces en seguida a los 30 minutos de las luces apagadas, y repetir varias veces.
5. A continuación, cierre la puerta de la cámara de grabación y comenzar la grabación.
6. En la práctica, registrar la actividad de cada uno de los peces por segundo, pero el software de punto de vista, de hecho, los registros de la trama por trama de datos (se refieren a la películapara una demostración de la recogida de datos). Establecer el valor umbral para el cambio de los píxeles mínimo por cuadro dependerá un poco de su cámara en particular y la configuración de la luz. Para nuestra configuración, por lo general utilizan un umbral de 4 píxeles, es decir, si menos de 4 píxeles están cambiando, se considera de fondo. Si hay más de 4 píxeles se están moviendo, indica que el pescado esté en movimiento. Empíricamente determinado que este corte detecta casi todos los movimientos de natación de larvas y vuelta.
7. A pesar de que las cajas de registro de aislar las larvas bastante bien, apagar la luz de la habitación y tener cuidado para minimizar las interrupciones con el ruido mecánico, tales como abrir y cerrar las puertas de la sala, con una fiesta de baile, o hacer sus rutinas de ejercicio.

Parte 4: Análisis de los datos

1. Después de que el experimento se ha completado, la transferencia de los datos recogidos en una hoja de Excel o en su suite de análisis favorita.
2. La adjunta hoja de Excel es un ejemplo de lo que los datos pueden ser: que contiene el tiempo en segundos desde el inicio del experimento y la actividad de cada larva por segundo para todos los peces durante todo el experimento (ver datos adicionales Ejemplo de archivo de la sección Archivos de esta página).
   
   
3. La figura 1 muestra un ejemplo de la actividad de una sola larva. La figura 2 es una huella representativa del promedio de 40 larvas de pez cebra WT. El promedio de ON y OFF respuestas son importantes y consistentes.
   
   
   
   Figura 1: Actividad de un solo pez La actividad de un solo pez PESO menos 5 fdd en respuesta a la alternancia de períodos de 30 minutos-luz de encendido y apagado.. Las respuestas sobre se indican con flechas de color negro y las respuestas OFF con flechas rojas.
   
   
   
   Figura 2: La actividad promedio de 40 peces La actividad media de 40 peces PESO menos 5 fdd en respuesta a la alternancia de períodos de 30 minutos-luz de encendido y apagado.. El promedio de ON (flechas en negro) y OFF (flechas rojas) las respuestas son importantes y consistentes.

5. Resultados representante

La Figura 3 es un plan esquemático del esquema experimental utilizado en todos nuestros experimentos.



Figura 3. El diseño experimental de la respuesta visual del motor (VMR) prueba. Un pez) individuales se colocan en una placa de 96 pozos en una cámara de grabación. La actividad de cada pez se mide por segundo. B) los peces se les da un período de adaptación a la oscuridad o la luz para su liquidación y para obtener un nivel de actividad de base. Períodos de 30 minutos las luces y las luces se introducen de manera consecutiva para un total de 3 horas. Este diagrama es una adaptación de Prober et al., 2006.

¿Qué significan los gráficos de la respuesta visual-motor parece?

Se midió la respuesta de encendido y apagado de los peces WT a incrementos y decrementos de la luz. Para confirmar que estas respuestas se depende de la función del ojo, se midió la actividad de los mutantes chk, que no desarrollan ningún ojos. La Figura 4 muestra la actividad media obtenida de animales WT, así como los mutantes chk.



Figura 4: pescado PESO tienen claro ON y OFF respuestas que están mediadas por la mirada lateral El comportamiento locomotor de las larvas de pez cebra a 5 fdd en respuesta a los 30 minutos de la luz y 30 minutos de apagado la luz se registra por segundo.. Cada trazo representa un promedio de 480 respuestas de 120 individuales WT (azul traza) o chk larvas mutantes (naranja traza) registró más de tres experimentos. Los mutantes chk no aumenten considerablemente su actividad a la luz ya sea incrementos o decrementos y tienen un nivel basal bajo de actividad. Esta figura es una adaptación de Emran et al., 2007.

Visual-Motor Las respuestas de los peces mutantes NRC.

El mutante NRC se pensaba que era completamente ciega basada en la prueba okr. En el mutante NRC, los terminales de los fotorreceptores no se forman adecuadamente y la vía visual El se ve gravemente comprometida ^1. Grabaciones de células ganglionares de la retina de los peces mutantes reveló que exhiben predominantemente fuera de tipo respuestas de las células ganglionares, algunos anormales ON-OFF, pero no puro en las respuestas de tipo ^2.

Mediante la prueba de VMR se demostró que el mutante NRC ha normal OFF-respuesta y un retrasado y lento en la respuesta (síe Figura 5). Por lo tanto, el mutante NRC no es completamente ciego como se pensaba anteriormente ^2.


Figura 5: mutats NRc aumentar su actividad en respuesta a cambios en la intensidad de la luz Las respuestas de comportamiento a la luz de encendido y apagado de WT y larvas NRC mutante de 5 fdd.. Cada trazo representa un promedio de 480 respuestas de 120 de peces individuales de cada genotipo. El comportamiento locomotor promedio de mutantes NRC (trazas de color rosa) se reduce ligeramente en comparación con los peces WT (azul) se mantiene vigorosa, pero siguiendo la luz OFF de estímulo. Tenga en cuenta el tiempo de subida lenta en la respuesta de la NRC mutante a la luz en comparación con la luz en la respuesta de los peces WT.

Discusión

Los procedimientos experimentales se muestra en la película son representativos de los peces WT. Sin embargo, estos experimentos se puede hacer de forma análoga en los peces mutantes, así (véase la sección representativa de resultados). Sugerimos a los peces placa WT y peces mutantes en el mismo plato en un esquema de tablero de ajedrez para el control óptimo.

Cuando se utilizan peces mutantes en el mismo plato como el pescado PESO asegurarse de que usted anote qué tipo de peces se colocaron en cada pozo. Aquí está una suge...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate devices	Tool	Whatman, GE Healthcare	7701-1651
Transfer pipetes	Tool	VWR international	202205
Fish water	Reagent			refer to reference #4
Recording chambers (Zebrabox)	Tool	Viewpoint Lifesciences
Videotrack Software	Tool	Viewpoint Lifesciences