El siguiente procedimiento proporciona los pasos detallados necesarios para recopilar imágenes in vivo y ex vivo DE NIRF de animales pequeños:

1. Configuración experimental

1. Conecte una fuente de luz de fibra óptica al sistema de imágenes de fluorescencia mediante una guía de luz de fibra óptica.
2. Seleccione el filtro de excitación adecuado para el experimento. El filtro de excitación determina la longitud de onda de la luz que se entregará a la muestra y debe elegirse para que coincida con el espectro de excitación del fluoróforo introducido en la muestra.
3. Seleccione el filtro de emisión adecuado. El filtro de emisión bloquea los componentes espectrales no deseados, que pueden atribuirse a la autofluorescencia, y deben elegirse para que coincidan con el espectro de emisión del fluoróforo.

2. Preparación de muestras

1. In Vivo
   1. Anestetizar al animal en una cámara de inducción utilizando isoflurano a una concentración de 3-4% en la esfera del caudalímetro.
   2. Transfiera el animal a un cono nasal que esté fijado en la etapa de toma de imágenes y mantenga el isoflurano en una concentración de 1-2%. Una fuente de calor no es necesaria porque los animales normalmente sólo se imaginan durante un corto período de tiempo (> 5 min), y su temperatura corporal no disminuye sustancialmente.
   3. Asegure las patas del animal para minimizar los artefactos de movimiento. Retire el vello de la región de interés aplicando una crema depilatoria.
   4. Aplicar crema depilatoria en la zona más pequeña necesaria. Después de 30 s, límpielo con una gasa. Limpie la zona por segunda vez con una gasa humedecida con alcohol etílico para eliminar por completo la crema depilatoria.
   5. Aplique pomada oftálmica en los ojos para evitar el secado de las córneas.
   6. Inyecte la sonda molecular fluorescente activa en el animal. Para esta aplicación específica, las sondas activables MMP2 se inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola. En este punto, se puede crear una imagen del ratón. Proceda a la "Adquisición de imagen" de este protocolo para continuar. Supervise al animal para la respiración regular durante todo el breve procedimiento.
2. Ex Vivo
   1. Después de la inyección de la sonda fluorescente, eutanasia al animal de una manera humana de acuerdo con las Directrices AVMA 2013 para la eutanasia de los animales. La sobredosis de dióxido de carbono (CO₂₎es una práctica estándar para la eutanasia de animales pequeños.
   2. Extraiga quirúrgicamente el tejido u órgano de interés y retire cuidadosamente el exceso de tejido adiposo con fórceps.
   3. Enjuague el tejido con solución salina tamponada de fosfato para eliminar la sangre residual y colocar la muestra directamente en la etapa de toma de imágenes.

3. Adquisición de imágenes

1. Abra el software de imágenes moleculares y encienda tanto la fuente de luz de fibra óptica como el sistema de imágenes de fluorescencia.
2. Abra la ventana de adquisición y especifique el tipo de exposición adecuado para el estudio. Las exposiciones disponibles incluyen: Exposición estándar para capturar una sola imagen, Exposición de lapso de tiempo para capturar una serie de imágenes en un intervalo de tiempo fijo y Exposición progresiva para capturar una secuencia continua de exposiciones en diferentes momentos de exposición.
3. Seleccione UV-Transillumination como fuente de iluminación.
4. Utilizando la imagen previsualizada como referencia, ajuste el enfoque de la lente, el campo de visión y la f-stop/aperture en la cámara del sistema de captura para optimizar la calidad de imagen muestreada. Ajuste el tiempo de exposición y la posición de la muestra.
5. Cierre la ventana de vista previa y asegúrese de que todos los parámetros de la ventana de adquisición coincidan con la configuración de la cámara y el filtro.
6. Haga clic en 'Exponer' para adquirir y guardar la imagen.
7. El software de imágenes moleculares estándar normalmente proporciona una variedad de herramientas analíticas, de medición y de corrección de imágenes para cuantificar las señales de fluorescencia para el análisis de imágenes.
8. Al final de la sesión de imágenes, retire la muestra/animal, apague el sistema y limpie la etapa de diagnóstico para minimizar los daños en el sistema.