Agradecemos al Dr. Nicola Wiethölter para la preparación y tinción de 1-D geles. Este trabajo fue financiado por una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 a ND y SM) y apoyado por una beca de investigación de la Fundación para Manchot Jürgen Key.

Parte 1: en dos dimensiones (2-D) usando electroforesis en gel de taza de carga <ol><li> IPG-tira la rehidratación y el isoelectroenfoque (IEF) <ul><li> Rehidratar geles Immobiline DryStrip, pH 6-11 (7 cm) en más de 125 soluciones de rehidratación l [7 M urea, 2 M tiourea, CHAPS 4%, 50 mM hydroxyethyldisulfide y el 2% IPG Buffer pH 6.11] utilizando la bandeja DryStrip Immobiline Reswelling para por lo menos 10 horas. </li><li> Disolver la muestra proteína precipitada en tampón de muestra IEF [7 M urea, 2 M tiourea, CHAPS 2%, 2% de ASB-14, 50 hydroxyethyldisulfide mM y 2% IPG Buffer pH 6.11] correspondiente a la proteína de 60 a 100 mg por cada 100 l . </li><li> Después de la solubilización (por lo menos 30 minutos a temperatura ambiente), aplicar la muestra a través de la proteína anódica taza de carga con copas de muestra. El volumen de la copa es de 100 l (vasos colectores permiten hasta 150 l). Nota: puede cargar grandes cantidades de muestra si se inserta un paso de baja tensión en el comienzo del protocolo de centrarse y volver a llenar las copas, mientras que todavía hay una película de líquido en la copa! </li><li> Realizar isoelectroenfoque de 11.1 KVH en el modo de degradado en la unidad de electroforesis Multiphor II. </li></ul></li><li> Equilibrio y SDS-PAGE <ul><li> Después de IEF, las tiras IPG fueron sometidos a reducción y alquilación, cada vez 15 minutos en un agitador, utilizando el 1% y el 2,5% ditiotreitol yodoacetamida, respectivamente, en solución de equilibrio [50 mM Tris-HCl/pH 8,8, 6 M urea, glicerol al 30% y el 2% SDS]. </li><li> Enjuague las tiras de equilibrio con H 2 O y borrar ellas en papel Whatman para eliminar el exceso de tampón de equilibrado. Luego sumergir las tiras en SDS-funcionamiento de amortiguación (1X). </li><li> La segunda dimensión se realiza mediante SDS-PAGE en un sistema de electroforesis vertical con una concentración de acrilamida total del 12%. Las tiras de IPG equilibrio se colocaron en la parte superior de los geles de separación y se fija con calor solución de agarosa [0,5% de agarosa en el funcionamiento de un tampón que contiene azul de bromofenol]. </li><li> Las proteínas fueron separadas de 2,5 horas, a partir de 80 V durante 15 minutos seguido de 120 V hasta que el frente tinte llega a la parte inferior de la cassette de gel. </li></ul></li></ol> Parte 2: tinción de Coomassie coloidal con CBB G-250 1. Soluciones de tinción Nota: para la preparación de las soluciones de tinción, utilice productos químicos de alta calidad tales como la calidad analítica (pa) y agua de alta pureza que se obtiene de los sistemas de Millipore (agua Milli-Q). <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Coomassie solución: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 0,02% (w / v) </td><td> CBB G-250 </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> 5% (w / v) </td><td> sulfato de aluminio (14-18)-hidrato </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> etanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> de ácido ortofosfórico (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table><ol> Nota: para la preparación de la solución colorante, la adición secuencial de los componentes en el siguiente orden tiene que ser mantenido: <li> primero disolver el sulfato de aluminio en agua Milli-Q </li><li> después añadir etanol, homogeneizar y mezclar CBB G-250 a la solución </li><li> en fecha tan reciente como la solución esté completamente disuelto, añadir ácido fosfórico (la incorporación de los ácidos de los medios de comunicación permite a las moléculas de alcohol Coomassie agregado a su estado coloidal) </li><li> finalmente se llenan de agua Milli-Q </li></ol> Nota: la solución final tiene una coloración verde oscuro azulado aspecto y está lleno de partículas nadando a su alrededor: <ul><li> No filtrado esta solución! </li><li> Si ha cambiado el orden de la preparación, se llega a una solución más violeta-azulado que es menos sensible. </li></ul><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Decoloración de solución: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> etanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> de ácido ortofosfórico (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> 2. Procedimiento de tinción <ul><li> Después de la separación segunda dimensión, retirar con cuidado el gel de las placas de vidrio y transferirlos a un plato lleno de manchas agua Milli-Q. </li><li> Lavado de los geles de tres veces con agua Milli-Q durante 10 minutos en un agitador horizontal (lavado insuficiente hace que la baja sensibilidad ya que el resto de SDS en los geles perturba la delimitación del colorante a la proteína). </li><li> Agite la solución de Coomassie antes de su uso para dispersar las partículas coloidales de manera uniforme. </li><li> Incubar los geles bien cubiertos con la solución de Coomassie por la agitación en un agitador durante 2-12 horas. Esta tinción de fondo genera marginal para que pueda observar el progreso de manchas en el medio. Nota: después de 10 minutos se pueden ver manchas de proteínas que aparecen primero, dentro de las 2 horas de incubación de manchar el 80% de su máximo nivel se ha completado. Para la tinción de casi el 100%, incubación durante la noche se recomienda. En algunos casos, cuando la cantidad de proteínas que ha manchado es enorme y la solución se convierte en un azul brillante, una actualización de la solución de tinción es necesario. </li><li> Después de que el procedimiento de tinción de extraer la solución de Coomassie y enjuague los geles dos veces con agua Milli-Q. Nota: puede volver a utilizar la solución de tinción, siempre y cuando las partículas están todavía pendientes, de lo contrario, descarte (tenga en cuenta que el laboratorio puede tener una reglamentación especial para la eliminación de residuos). </li><li> Eliminar las partículas de colorante se pegue en el plato la tinción con un paño y una toalla de papel destain de 10 a 60 minutos. Nota: También puede lavar el gel sólo con agua Milli-Q, pero esto se recomienda sólo para los geles de preparación debido a que tendrá una duración de una película irregular, débil Coomassie de los geles que se presentarán durante el proceso de escaneado. </li><li> Por último, enjuagar los geles dos veces con agua Milli-Q: los geles llegará a su espesor original (el medio ácido con el alcohol hace que la reducción de gel) y la neutralización en el agua, además, aumenta la intensidad de color de Coomassie. </li></ul> Parte 3: Los resultados representativos Si usted sigue el protocolo descrito anteriormente obtendrá en el 2-D gel distintivo resuelto y se tiñen y las manchas oscuras de proteínas azul. Incluso en comparación con un gel 2-D se tiñeron con plata de acuerdo a Shevchenko et al. 5, un protocolo de reclamar una buena sensibilidad y la compatibilidad con la espectrometría de masas, podemos lograr los mismos resultados de tinción. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Resultado final de la experimentación se ha descrito anteriormente. Coomassie Kang protocolo (A) lleva a cabo con fuerza, como la tinción de plata de acuerdo a Shevchenko et al. (B) en la detección de las proteínas después de 2-D electroforesis en gel. Parte 4: Consejos y trucos <ul><li> Realizar algunas coloraciones de prueba antes de procesar sus propias muestras. Por razones inexplicables a veces nos informó que una proteína de interés no puede ser detectado con éxito, incluso cuando se han aplicado miligramos. En este caso se recomienda para preparar algunas series de dilución para prueba de sensibilidad. </li><li> Si usted tiene bajos en gel de detección de la proteína (s) en la transferencia general, sin éxito desde el apilamiento a la separación de gel durante la SDS-PAGE, posiblemente, será la razón. Puede comprobar si tales proteínas adhesivas mediante la tinción del gel completo, incluyendo la zona de apilamiento. </li><li> Para una verificación rápida de los resultados de isoelectroenfoque, usted directamente puede manchar las tiras de IPG-sin ninguna separación segunda dimensión adicional. </li><li> De vez en cuando a su vez los geles durante el procedimiento de tinción para que se tiñen uniformemente por ambos lados (si sigues los geles impasible, el tinte sólo se une a un lado del gel). </li><li> Hemos experimentado que el almacenamiento de la solución colorante en un frasco oscuro aumenta su vida útil (en botellas transparentes de hasta 4 meses). </li><li> Después de la tinción y la documentación que pueda mantener los geles en la nevera durante varios años (si se añade una solución ácida que evitar la contaminación por hongos). </li><li> Decoloración de los tapones de gel para un tríptico resumen puede ser acelerado por el calentamiento en un calentador de bloque. </li></ul>

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	<li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips.">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+Silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li></ol>

Innovadora o simplemente un protocolo de Coomassie? Por el momento existen varios protocolos para los procedimientos de tinción con Coomassie Brilliant Blue. La mayoría de ellos consecuencia de las modificaciones de menor o mayor de uno de los protocolos más utilizados por Neuhoff y colegas 2. También protocolo Kang está basado en la fórmula de Neuhoff. Pero en realidad es un método alternativo de Coomassie tinción para la investigación proteómica? Vamos a imagen dos cue...

<table border="1" ><tr><td> Nombre del producto </td><td> Empresa </td><td> Catálogo N º </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Para el IEF y SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip geles </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> Se puede utilizar incluso dos años después de la fecha de caducidad. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Reswelling bandeja </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> No utilice disolventes orgánicos. Diseñado para 7-18 cm IPG tiras. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> Incluye una bandeja de electrodos, porta-electrodos, un ánodo y el cátodo, alineador y un bar de la Copa de la muestra y copas de muestra. </td></tr><tr><td> EPS 3501 XL fuente de alimentación </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> Fuentes de voltaje de hasta 3500 V. </td></tr><tr><td> Multiphor II unidad de electroforesis </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> Electrodos móviles permiten IEF en tiras IPG de toda la longitud (24.07 cm IPG strips) </td></tr><tr><td> PerfectBlue gel sistema de doble S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE en 10x10 cm mini-gel de formato. Gel de la cámara incluye un sistema de refrigeración. </td></tr><tr><td> De Coomassie coloidal G-250 tinción: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> tinción con tapas de cierre </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> Se adapta para mini-geles. Apilables en la coctelera. </td></tr><tr><td> sulfato de aluminio-18-hidrato </td><td> Merck </td><td> 1.01102.5000 </td><td> Hicimos mejor experiencia con Merck. Sólo disponible en el paquete de 5 kg. </td></tr><tr><td> de ácido ortofosfórico </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> Se vende en botellas de vidrio. </td></tr></table>

fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) es un colorante utilizado para la visualización de proteínas separadas por SDS-PAGE, que ofrece un procedimiento de tinción simple y cuantificación de alta. Además, es totalmente compatible con la identificación de proteínas por espectrometría de masas. Pero a pesar de estas ventajas, el BCB se mira para ser menos sensible que la plata y coloraciones de fluorescencia y por lo tanto, rara vez se utiliza para la detección de proteínas en analíticas proteómicas a base de gel. Mejoras en varios de los originales una Coomassie protocolo se han hecho para aumentar la sensibilidad de la broca. Dos importantes modificaciones fueron introducidas para mejorar la detección de proteínas poco abundantes mediante la conversión de las moléculas de colorante en las partículas coloidales: En 1988, Neuhoff y sus colegas aplicaron 20% de metanol y una mayor concentración de sulfato de amonio en el CBB G-250 basado en solución de tinción 2, y en 2004 al Candiano et. establecido con Blue Silver CBB G-250 con ácido fosfórico en la presencia de sulfato de amonio y metanol 3. Sin embargo, todas estas modificaciones sólo permiten una detección de la proteína de aproximadamente 10 ng. Un protocolo muy fameless para la tinción de Coomassie coloidal fue publicado por Kang et al. En 2002 en el que modificaron coloidal Neuhoff el protocolo de tinción con respecto a la CBB complejantes. En lugar de sulfato de amonio se utiliza sulfato de aluminio y el metanol fue sustituido por el 4 de etanol menos tóxicos. La base de aluminio nuevas manchas en el estudio de Kang mostró mayor sensibilidad que detecta tan bajo como 1 ng / banda (fosforilasa b) con una variación poco de sensibilidad en función de las proteínas. En este sentido, demostrar la aplicación del protocolo de Kang para la tinción coloidal rápida y sensible de Coomassie de proteínas en la realización de análisis. Vamos a ilustrar el protocolo rápida y sencilla con dos dimensiones geles realizada de forma rutinaria en nuestro grupo de trabajo.

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Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Este vídeo se popularizar un Coomassie coloidal G-250 protocolo de tinción de acuerdo con Kang<em&gt; Et al.</em&gt; Para la detección de la proteína promedio de 4 ng en geles. La tinción se completa en 2 horas y sin ningún esfuerzo. Nosotros usamos el protocolo de Kang para fines de análisis en gel a base de la proteómica.

Rápido y sensible coloidal Coomassie G-250 La tinción de proteínas en geles de poliacrilamida

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

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40.0K vistas.  University Duesseldorf. Este vídeo se popularizar un Coomassie coloidal G-250 protocolo de tinción de acuerdo con Kang Et al. Para la detección de la proteína promedio de 4 ng en geles. La tinción se completa en 2 horas y sin ningún esfuerzo. Nosotros usamos el protocolo de Kang para fines de análisis en gel a base de la proteómica.

Video: Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Tinción de proteínas en geles de

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Investigación

Biología

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para la tinción de anticuerpos enteros en el monte del polluelo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Poliacrilamida electroforesis en gel de urea (urea PÁGINA)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

La medición de flujos rápidos de calcio en los cardiomiocitos

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Una estrategia para sensibles, grande escala cuantitativa Metabolómica

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

Desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de Cetáceos mioglobina

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

La detección de formas modificadas de la citosina Uso Sensitive Inmunohistoquímica

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa utilizando la detección basada en el monitoreo de reacciones múltiples de proteínas del tejido cerebral humano

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

Detección de glicosaminoglicanos por electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de plata

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...