Este es un novedoso método de tinción de gel que utiliza una sonda de plata fluorogénica para convertir la tinción tradicional de plata en una mancha de plata fluorescente. Este método mostró un rendimiento mejorado en comparación con la tinción convencional de nitrato de plata y la tinción de rubí SYPRO mientras se utiliza un protocolo simple y sencillo sin aldehídos. Demostrar el procedimiento estará Alex Wong, un asistente de investigación de mi laboratorio.
Para comenzar este procedimiento, diluya las muestras de proteínas con una solución que contenga agua destilada, tampón SUD y un agente reductor de muestras. Configure un mini tanque de gel lleno de tampón MES para realizar SDS-PAGE con un gel proteico 4-12%Bis-Tris. Cargue los pozos con la muestra de proteína preparada, luego ejecute el gel a una tensión constante de 200 voltios durante 30 minutos.
Después de la electroforesis, sumerja el gel en una solución de 100 mililitros que contenga etanol y ácido acético en un agitador orbital e incubar dos veces durante 30 minutos cada uno a temperatura ambiente mientras se agita a 50 rpm. A continuación, lave el gel tres veces con agua ultrapura en un recipiente limpio con cada lavado que dure 10 minutos. En primer lugar, disolver 0,01 gramos de nitrato de plata en 10 mililitros de agua ultrapura para preparar una solución de stock con una concentración de 0,1% Añadir 100 microlitros de la solución de stock en 100 mililitros de agua ultrapura para hacer la solución de trabajo de nitrato de plata.
En una campana de humo, sumerja el gel en 100 mililitros de la solución de trabajo de nitrato de plata en una cámara de vidrio sellada. Utilice papel de aluminio para proteger el gel de la luz durante la impregnación e incubar durante una hora mientras agita a 50 rpm en un agitador orbital. Después de esto, lave el gel dos veces con agua ultrapura en un recipiente limpio, con cada lavado con aproximadamente 100 mililitros de agua y con una duración de 60 segundos.
Es importante utilizar agua ultrapura para limpiar el gel después del paso de impregnación de plata para minimizar la tinción de fondo. Primero, agregue 50 mililitros de agua ultrapura a tres miligramos de tinte TPE-4TA. Sonicar la solución durante tres minutos y añadir cinco microlitros de solución de hidróxido de sodio de un molar entre cada sesión de sonicación para ayudar a disolver el tinte, por lo general hasta tres veces.
A continuación, compruebe la fluorescencia de la solución bajo una lámpara UV de 365 nanómetros para asegurarse de que el tinte está completamente disuelto. Sólo las soluciones débiles o no emisivas indican la disolución completa. Para preparar la solución de desarrollo fluorogénico, añada 10 mililitros de la solución de stock TPE-4TA a 90 mililitros de agua ultrapura.
Utilice un medidor de pH para comprobar el pH de la solución. Ajuste la solución a un pH entre 7 y 9, utilizando solución diluida de hidróxido de sodio o ácido acético si el pH está fuera de alcance. A continuación, transfiera el gel a un recipiente limpio y sellable con 100 mililitros de la solución de desarrollo fluorogénico y asegúrese de que el gel esté completamente sumergido.
Selle el recipiente y cúbralo para protegerlo de la luz. Agitar el recipiente durante la noche en un agitador orbital a 50 rpm y a temperatura ambiente. Transfiera el gel a un recipiente limpio y deténgalo en 100 mililitros de 10% de etanol durante 30 minutos.
A continuación, enjuague el gel en agua ultrapura durante cinco minutos. El gel se puede visualizar en un transilluminador de sobremesa o visualizarse en una máquina de documentación de gel en el canal de 365 nanómetros o en el canal de 302 nanómetros. En este estudio, se utiliza un novedoso método de tinción de plata fluorescente para manchar proteínas en geles de poliacrilamida.
Las bandas de proteínas teñidas por la mancha de plata fluorescente exhiben un verde intenso bajo una lámpara UV de 365 nanómetros. Las 14 bandas de proteínas son claramente visibles y se correlacionan bien con las bandas de color rojo teñidas por el tinte SYPRO Ruby. Este método de tinción de plata fluorescente parece tener una alta resolución.
Para algunas bandas de proteínas, la sensibilidad de la mancha de plata fluorescente también es ligeramente mejor que la de la mancha fluorescente SYPRO Ruby. En particular, se mejora el rendimiento de esta mancha para las bandas de proteínas entre 10 y 40 kilodaltones, lo que indica que el nuevo método es particularmente útil para la detección de proteínas con un bajo peso molecular. Como se puede ver, los datos también sugieren que la mancha de plata fluorescente da una buena y uniforme linealidad para las 14 proteínas en una gama relativamente amplia de cuantificación de proteínas.
Mientras que la mancha de nitrato de plata dio un alto nivel de señal de fondo y picos distorsionados, la mancha de plata fluorescente detectó las bandas con buen contraste y distribución de intensidad uniforme comparable a la mancha SYPRO Ruby en las 14 proteínas. Los pasos de lavado son importantes, ya que limitan la solución de fijación residual de interrumpir la impregnación de plata o el desarrollo fluorogénico. Cuando utilice nitrato de plata, evite el contacto con la piel.
Limpie los derrames inmediatamente. Use ropa y guantes de protección y deseche como residuos químicos.
