La preparación de los explantes epiteliales de la lente ha sido adaptado de los métodos se originó en el laboratorio del Dr. John McAvoy 9. Este trabajo está financiado por el National Eye Institute, Programa de Investigación Intramural Z01-EY000238-22

Parte 1: La eliminación de las lentes Materiales y reactivos: <ol><li> Micro-Tijeras de disección, puntas curvas, romas, (por ejemplo as.RS-5983, Roboz quirúrgica Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD), micro-disección pinzas, punta curva (como Roboz # RS5137). </li><li> Medio de suspensión: Medio 199 conteniendo 0,1% de albúmina de suero bovino, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100μg/ml, 2,5 mg / ml Reactivos anfotericina B. están disponibles a partir de Invitrogen, Carlsbad, CA. </li></ol> Procedimiento: <ol><li> La eutanasia a las ratas recién nacidas (de 2-4 días), de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD. </li><li> Eliminar los párpados con una tijera quirúrgica. Presione suavemente con unas pinzas curvas en los lados opuestos de la órbita del ojo para forzar el ojo pared hacia afuera. Haga una pequeña incisión en la parte posterior del ojo con las tijeras. Pulsando con pinzas contra el lado del ojo frente a la incisión, la lente y una pequeña cantidad de vítreo adjunta a continuación, se puede forzar a través de la ruptura, lo que permite la lente para ser recogidos con pinzas curvas. Se debe tener cuidado de no romper la cápsula del cristalino. </li><li> Utilice las pinzas curvas para la transferencia de las lentes de 60 mm a un plato de plástico de 5 ml de cultivo de tejidos que contienen medio caliente, suspensión estéril. </li></ol> Parte 2: Microdisección de explantes Materiales y reactivos: <ol><li> Micro pinzas de disección, 0,1 mm de consejos, (como Roboz RS-4976). Usamos aleación Dumostar debido a la flexibilidad de la punta, pero otras aleaciones de acero también son aceptables. Pinzas con puntas de 0,1 mm más delgado que no son recomendables, ya que tienden a romperse o doblarse durante este procedimiento. </li><li> Suspensión medio (véase la Parte 1) </li><li> Sin suplementar F12 de Ham o medio 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> Procedimiento: <ol><li> Los siguientes pasos deben realizarse en un lugar limpio, sin corrientes de aire ambiente utilizando herramientas de disección estéril y medio estéril. </li><li> Utilizando un microscopio de disección estéreo, limpiar las lentes de los tejidos adheridos con la punta de pinzas 0,1 mm y transferirlos a una placa de cultivo con medio segundo de 60 mm 5 ml de suspensión estéril (este paso ayuda a reducir la contaminación). Con las pinzas, la transferencia de la cantidad deseada de lentes para una placa de cultivo de 35 mm que contiene 5 ml medio estéril, sin suplemento. (A menudo utilizamos F12 de Ham (Invitrogen) para este paso, porque la concentración de colorante más baja hace una disección más fácil, sin embargo, Medio 199 también es aceptable ningún antibiótico o cualquier otro tipo son necesarias en este paso..) Hasta 12 explantes se puede hacer en el centro de un plato de este tamaño. Sin embargo, un plato de 35 mm se debe utilizar, aunque menos explantes se deben hacer, ya que las herramientas de disección no se puede manipular con facilidad en un plato más pequeño. La transferencia de la cápsula que contiene las lentes restantes a un cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C hasta que se necesiten. </li><li> Identificar la parte posterior de la lente. Hay muchas maneras de reconocer esto: 1) La parte posterior es más redonda que la anterior, que es ligeramente achatada, 2) las lentes de recién nacidos de ratas forman cataratas en frío cuando se enfrían a temperatura ambiente durante la disección. Si la catarata fría no ha llenado completamente el objetivo, la parte posterior es la parte más alejada de la zona opaca. Si la opacidad ha llenado la lente, el calentamiento de la placa a 37 ° C durante unos minutos lo contrario. El lado posterior se puede identificar como las reformas de cataratas en la refrigeración. 3) Los vestigios de la túnica vascular del cristalino pueden ser visibles en la parte posterior. 4) La sutura posterior puede ser visible en la parte posterior. La identificación de la parte posterior correctamente es esencial, ya que es donde la cápsula se abrió. Apertura de la lente en la parte anterior se rompa el epitelio. </li><li> Una vez que la parte posterior se ha identificado, que a su vez hacia arriba y captar el lente de las pinzas de la izquierda (para un trabajador de la derecha). A continuación, una pizca de la cápsula posterior con las pinzas adecuadas para producir un pequeño pliegue. </li><li> Mientras mantiene la cápsula posterior con las pinzas derecha, sujete la tapa de la cápsula con las pinzas a la izquierda y tirar de los dos pares de pinzas en direcciones opuestas para hacer un pequeño desgarro en la cápsula. </li><li> Mientras sujeta el borde de la cápsula retráctil con las pinzas, tire de él hacia abajo, primero en un lado y luego por la otra, presionando en el plástico de la cápsula con las pinzas. Repita esto varias veces, moviendo todo alrededor del ecuador de la lente, hasta que la cápsula esté bien conectado a la placa en muchos puntos. De la cápsula en su lugar con las pinzas de la izquierda, agite suavemente la masa de las fibras con las pinzas derecho de romper la unión entre las células de las fibras y células epiteliales en el ecuador del cristalino. Luego empuje la masa de fibra de distancia, rodar fuera de la cápsula / epitelio, que permanece unido a la parte inferior de laplato. Continuar este proceso con todos los objetivos en el plato. Retire y deseche las masas de fibra (o guardarlos congelados como fuente de proteínas del cristalino para otros estudios). </li></ol> Parte 3: Microdisección y la cultura de los explantes centrales Materiales y reactivos: <ol><li> Desechable estéril de bisturí, hoja n. º 15, (Cincinnati quirúrgica Co. Cincinnati, OH) </li><li> Fosfato de solución salina estéril tamponada con calcio y magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Medio de cultivo: medio de suspensión que contiene 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. de St. Louis, MO). </li></ol> Procedimiento: <ol><li> Con un bisturí estéril, recortar el epitelio periférico (PE), que contiene las células en las primeras etapas de diferenciación (Figura 1), dejando una plaza central alrededor de 2,0 mm de lado, que consiste en el centro de las células epiteliales sólo (CE) (Figura 1B). </li><li> Transferir el plato que contiene los explantes central para un gabinete de bioseguridad. Lavar 3 veces con PBS estéril que contiene calcio y magnesio, y una vez con 1 ml de medio fresco, equilibrado y suspensión (37 ° C CO, 5% 2). Estas soluciones reducen en gran medida la probabilidad de contaminación. </li><li> Añadir 2 ml de medio de cultivo para inducir la diferenciación de una, y el lugar de los explantes en un humidificado, cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. Períodos de la cultura puede ser tan corto como unas pocas horas o extenderse hasta dos o tres semanas, dependiendo del parámetro en estudio. Medio debe ser cambiado cada dos o tres días. </li></ol> Parte 4: La recolección de los explantes para el análisis de los acontecimientos relacionados con la diferenciación 1. Explantes de recolección para el análisis de proteínas o ARN Materiales: <ol><li> Pinzas Microdissecting </li><li> Tampón de lisis SDS o ARN más tarde- </li></ol> Procedimiento: <ol><li> Al final del período de incubación, se elimina el medio de cultivo. </li><li> Con el microscopio de disección estéreo, extraiga con cuidado los bordes de cada explante. </li><li> Levante cada explante con las pinzas y transferirlo a un tubo que contiene buffer de lisis SDS 100μl (para el análisis de proteínas) o ARN más tarde (para el análisis de ARN). Agite la punta de las pinzas en la solución para asegurar que el explante no se pegue a las pinzas. </li></ol> 2. Explantes de la cosecha de inmunofluorescencia Materiales y reactivos: <ol><li> Tampón fosfato salino con calcio y magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Tampón fosfato salino (sin calcio y magnesio) (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Paraformaldehído al 4% (Bioproducts Boston, Worcester, MA) </li><li> Pinzas Microdissecting </li><li> Pluma hidrofóbicas marca </li><li> Portaobjetos de vidrio </li><li> 0,25% de Triton X-100 en tampón fosfato salino. </li></ol> Procedimiento: <ol><li> Enjuague explantes brevemente en PBS que contenía calcio y magnesio. </li><li> Para reparar tejidos mediante la adición de 4% de paraformaldehído durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Retire el fijador y reemplazar con tampón fosfato salino. Explantes se fija un poco rígida, lo que les permite ser levantado y trasladado a las diapositivas de cristal para inmunotinción. </li><li> Coloque una pequeña gota de PBS (sin calcio y magnesio) en la diapositiva para ayudar a posicionar el tejido y evitar que se ondulen. Con unas pinzas microdissecting, levante el explante y la inserta en la caída en la diapositiva. Sin tocar el explante, retire con cuidado el líquido con una mecha de papel para aplanar el explante en el cristal y dejar que el tejido seco en el aire a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 A. El epitelio periférico expresa una diferenciación específica de las proteínas. El explante mostró fue immunostained para N-cadherina inmediatamente después de microdisección. Expresión se ve en una banda de células en el epitelio periférico, lo que indica que las células de esta región han empezado a diferenciarse. B. El epitelio periférico puede ser recortada para eliminar las células que expresan N-cadherina y otras proteínas de diferenciación específica. El anillo de color rojo representa la ubicación de las células que expresan N-cadherina, mientras que la pequeña plaza que se indica en gris representa el cuadrante del epitelio muestra en el panel 1A. El epitelio periférico puede ser removido por cuatro cortes de bisturí, dejando una plaza central que contiene las únicas células que todavía no han empezado a diferenciarse.

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	<li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration.">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li><li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium.">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+(FGF).">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li><li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+major+intrinsic+protein+(MIP)/aquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling.">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li><li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation.">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+(ERK1/2)+signalling.">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li><li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene.">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li><li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6,+c-Maf,+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin.">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li><li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants.">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li></ol>

El objetivo de la rata sistema de explante ha sido utilizado con éxito por una serie de laboratorios para estudiar la diferenciación terminal de las células epiteliales de la lente de las fibras del cristalino 21,3,4,5. Cuando se expone a FGF-2 en 100ng/ml los explantes comenzará a mostrar cambios en la señalización dentro de 6 minutos, con cambios en la morfología y la expresión de genes que aparecen de forma secuencial durante varios días 3,4,5. Las culturas permanecen viables durante 2-3 semanas si se tiene cuidado para evitar la contaminación. Los explantes central descrito en este protocolo son especialmente útiles para el estudio de la secuencia de eventos asociados con la diferenciación, ya que contienen pocas o ninguna las células que expresan marcadores de diferenciación antes de FGF-2 se añade 1,5. Las células se diferencian de forma sincrónica, como un grupo, por lo que es posible seguir la evolución temporal de las señales y los eventos asociados con la diferenciación de la transcripción. Explantes de cultivo para diferentes periodos de tiempo por lo tanto proporciona información precisa acerca de los eventos temporales de secuencia. Inhibidores específicos se pueden añadir al medio de cultivo para identificar las vías de señalización correspondiente. Los explantes se puede utilizar para analizar la expresión de proteínas por electroforesis en gel de SDS e inmunoblotting o para analizar la expresión de ARNm específicos por RT-PCR. Proteínas gama rendimientos 20-50 mg / explante y el rendimiento de ARN es de aproximadamente 200 a 600 ng / explante, dependiendo de la duración del período de cultivo. Por lo general, encontramos que 6.5 explantes por plato proporcionará suficientes proteínas o ARN de varios ensayos. ARN a partir de explantes también se puede utilizar para preparar cDNA para la evaluación de la expresión génica mediante análisis de microarrays, que permiten identificar nuevos genes que pueden ser críticos para la diferenciación. Los explantes pueden ser transfectadas. A pesar de la eficiencia de transfección es generalmente bajo, es suficiente para el ensayo de genes indicadores 4, 7, 8. Microscopio de inmunofluorescencia de los explantes proporciona un complemento útil a los métodos bioquímicos para determinar la localización subcelular de las proteínas de interés. Por lo tanto, la preparación y la cultura de los explantes lente rata ofrece un potente sistema para el estudio de la diferenciación terminal de lentes en los mamíferos, que pueden complementar las técnicas in vivo, tales como la generación de ratones transgénicos y knock-out.

preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation

La superficie anterior del cristalino ocular está cubierta por una monocapa de células epiteliales, que proliferan en una zona anular subyacente del cuerpo ciliar. Después de la división, estas células migran posteriormente, en la difusión de la retina FGF induce a diferenciarse en una amplia posterior alargada de las células del cristalino fibras que componen el grueso de la lente. Diferenciación de las células epiteliales de la lente en las fibras del cristalino puede ser inducida in vitro por cultivo de explantes de la región central del epitelio anterior en presencia de FGF-2. Explantes son preparados a partir de las lentes de ratas recién nacidas por la extirpación del cristalino del ojo y agarrar la cápsula del cristalino en la parte posterior con unas pinzas de disección. La cápsula posterior es suavemente desgarrado y se presiona hacia abajo en la parte inferior de plástico de un plato de cultivo de tejidos. Las regiones periféricas del explante se quitan con un bisturí y la zona central luego se cultiva en presencia de 100ng/ml FGF-2 durante el tiempo de 2-3 semanas, dependiendo de los parámetros a estudiar. Dado que las células epiteliales en explantes cultivados diferenciar en sincronía aproximada durante un período de días o semanas, el curso temporal de la señalización y la expresión génica se puede determinar mediante técnicas moleculares, bioquímicos y farmacológicos. La inmunofluorescencia es un auxiliar poderoso de estos métodos, ya que demuestra la localización subcelular de las proteínas de interés y puede revelar las consecuencias fisiológicas de manipulaciones experimentales de las vías de señalización.

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Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Explantes de la región central de la lente de la rata epitelio diferenciar sincrónicamente cuando se cultivan en presencia de FGF-2. Microscopio de inmunofluorescencia de esas culturas puede ofrece información novedosa sobre la expresión génica y la señalización de eventos relacionados con la diferenciación terminal.

Preparación y Cultura de la lente explantes Rata epiteliales para el estudio de la diferenciación terminal

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

preparation-culture-rat-lens-epithelial-explants-for-studying

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.6K vistas.  National Eye Institute (NEI), National Institutes of Health (NIH). Explantes de la región central de la lente de la rata epitelio diferenciar sincrónicamente cuando se cultivan en presencia de FGF-2. Microscopio de inmunofluorescencia de esas culturas puede ofrece información novedosa sobre la expresión génica y la señalización de eventos relacionados con la diferenciación terminal.

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Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Cultura Cortar organotípicos de los cerebros de ratas E18

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Investigación

Biología

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

Preparación de balas de cañón de genes y transfección biolística de neuronas en cultivo Cortar

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primaria células epiteliales bronquiales Cultivada a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Preparación de los tendones Cola de Rata de Estudios biomecánicos y Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un sistema para el cultivo de células epiteliales del pigmento del iris para el Estudio de Regeneración del objetivo de Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

Un nuevo método para la Cultura y polarizado estimulación de explantes mucosa intestinal humana

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Preparación de suero de rata Adecuado para mamíferos Whole cultivo de embriones

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Lente libre Video microscopia para la dinámica y el análisis cuantitativo del cultivo de células adherentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Aislamiento, purificación y diferenciación de los precursores de osteoclastos de la médula ósea de rata

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...