وقد تم تكييف إعداد explants عدسة الظهارية من أساليب نشأت في مختبر الدكتور جون ماكافوي 9. ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعيون ، جماعية برنامج بحوث - Z01 EY000238 - 22

الجزء 1 : إزالة العدسات المواد والكواشف : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجزئي تشريح مقص ، منحنية ، نصائح صريحة ، (مثل as.RS - 5983 ، Roboz الجراحية المحدودة الصك ، المؤتمر الوطني العراقي ، غايثرسبيرغ ، MD) ؛ الدقيقة تشريح الملقط ، غيض المنحني (مثل Roboz RS5137 #). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق المتوسطة : متوسطة تحتوي على 199 0.1 ٪ ألبومين المصل البقري ، و 100 وحدة / مل البنسلين ، 100μg/ml الستربتوميسين ، و 2.5 ميكروغرام / مل الكواشف الامفوتريسين باء متاحة من Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا. </li></ol> الإجراء : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران حديثي الولادة (الذين تتراوح أعمارهم بين 2-4 أيام) وفقا للمبادئ التوجيهية التي تقدمها المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، دكتوراه في الطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجفون مع مقص جراحي. اضغط بلطف مع ملاقط منحنية على جانبي تجويف العين إلى العين إلى قوة انتفاخ في الخارج. إجراء شق صغير في الجانب الخلفي من العين مع المقص. بالضغط مع ملاقط ضد الجانب المعاكس للعين الشق ، يمكن عندئذ العدسة وكمية صغيرة من الجسم الزجاجي المرفقة ستضطر من خلال تمزق ، مما يسمح التقطت عدسة مع ملاقط منحنية. وينبغي الحرص على عدم الخروج من كبسولة العدسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملاقط منحنية لنقل عدسات ل60mm البلاستيكية التي تحتوي على نسيج الثقافة طبق 5ml الدافئة والمتوسطة تعليق العقيمة. </li></ol> الجزء 2 : Microdissection من explants المواد والكواشف : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الملقط الصغير ، نصائح 0.1 ملم ، (مثل Roboz RS - 4976). نحن نستخدم السبائك Dumostar بسبب مرونة من طرف ، ولكن سبائك الصلب الأخرى مقبولة أيضا. لا ينصح ملاقط مع نصائح أرق من 0.1mm ، كما أنها تميل إلى كسر أو الانحناء أثناء هذا الإجراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق المتوسطة (انظر الجزء 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Unsupplemented هام لF12 متوسطة أو متوسطة 199 (Invitrogen ، Carlsburg ، CA) </li></ol> الإجراء : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي القيام بالخطوات التالية في بيئة نظيفة وخالية في مشروع باستخدام أدوات معقمة تشريح والمتوسطة العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر ستيريو تشريح ، وتنظيف العدسات من أي نسيج الانضمام مع ملاقط 0.1 ملم طرف ونقلها إلى طبق الثقافة 60mm ثانية تحتوي على 5ml المتوسطة تعليق العقيمة (هذه الخطوة تساعد على الحد من التلوث). مع ملاقط ، ونقل العدد المرغوب فيه من العدسات لصحن يحتوي على ثقافة 35mm 5ml عقيمة ، unsupplemented المتوسطة. (ونحن غالبا ما تستخدم F12 هام ل(Invitrogen) لهذه الخطوة ، وذلك لأن انخفاض تركيز الصبغة يجعل تشريح أسهل ، ولكن متوسط ​​199 غير مقبولة أيضا ليست هناك حاجة المضادات الحيوية أو إضافات أخرى خلال هذه الخطوة..) والعديد من يمكن إجراء 12 explants في وسط طبق هذا الحجم. ومع ذلك ، ينبغي استخدام طبق 35 ملم حتى لو أقل explants أن تكون المقدمة ، لأنه لا يمكن التلاعب أدوات تشريح بسهولة في أصغر طبق. نقل الطبق الذي يحتوي على عدسات المتبقية لنسيج الثقافة في الحاضنة 37 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على الجانب الخلفي من العدسة. هناك طرق عديدة لإدراك هذه الحقيقة : 1) والخلفي والأمامي من مستدير ، وهو بالارض قليلا ؛ 2) العدسات الفئران حديثي الولادة شكل إعتام عدسة العين الباردة عندما تبرد إلى درجة حرارة الغرفة أثناء تشريح. إذا ساد الباردة لم تملأ تماما العدسة ، فإن الجانب الخلفي هو الجانب الأبعد من منطقة مبهمة. إذا كان التعتيم قد ملأت العدسة ، والاحترار الطبق الى 37 درجة مئوية لمدة بضع دقائق سيكون عكس ذلك. يمكن التعرف على الجانب الخلفي حيث ساد الإصلاحات على التبريد. 3) يجوز بقايا من الغلالة الوعائية للعدسة تكون مرئية على الجانب الخلفي. 4) يجوز للخياطة الخلفي تكون مرئية على الجانب الخلفي. التعرف على الجانب الخلفي بشكل صحيح أمر أساسي ، لأن هذا هو المكان الذي سيتم فتح الكبسولة. وفتح العدسة على الجانب الأمامي المسيل للدموع على ظهارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم التعرف على الجانب الخلفي ، وتحويلها إلى أعلى وفهم العدسة في ملاقط اليسار (للعامل الحق الوفاض). قرصة ثم الكبسولة الخلفية مع ملاقط الحق في انتاج طية صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين عقد الكبسولة الخلفية مع ملاقط الحق ، فهم حظيرة كبسولة مع ملاقط اليسار وسحب اثنين من أزواج ملاقط في اتجاهين معاكسين لجعل المسيل للدموع صغيرة في الكبسولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما يمسك حافة الكبسولة التراجع مع ملاقط ، تسحبه إلى الأسفل ، أولا على جانب واحد ، ثم من ناحية أخرى ، والضغط عليه في طبق من البلاستيك مع ملاقط. كرر هذا عدة مرات ، وتتحرك في جميع أنحاء خط الاستواء من العدسة ، حتى يرد بحزم الكبسولة الى لوحة في العديد من النقاط. عقد الكبسولة في المكان مع ملاقط اليسار ، الصخرة بلطف كتلة الألياف مع ملاقط الحق في كسر مرفق بين الألياف والخلايا الظهارية خلايا العدسة عند خط الاستواء. ثم دفع كتلة الألياف بعيدا ، المتداول تشغيله الكبسولة / ظهارة ، التي لا تزال تعلق على الجزء السفلي منالطبق. تستمر هذه العملية مع جميع العدسات في الطبق. إزالة ورفض الجماهير الألياف (أو حفظها مجمدة باعتبارها مصدرا للبروتينات العدسة للدراسات أخرى). </li></ol> الجزء 3 : Microdissection وثقافة explants المركزية المواد والكواشف : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المتاح مشرط معقم ، # 15 شفرة (سينسيناتي الجراحية المحدودة سينسيناتي ، أوهايو) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفوسفات مخزنة المالحة عقيمة مع الكالسيوم والمغنيسيوم (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستنبت : متوسطة تعليق يحتوي 100ng/ml FGF - 2 (سيغما الدريخ ، وشركة سانت لويس ، MO). </li></ol> الإجراء : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط معقم ، وتقليم بعيدا ظهارة الطرفية (PE) ، الذي يحتوي على الخلايا في المراحل الأولى من تمايز (الشكل 1A) ، وترك الساحة المركزية 2.0mm تقريبا على الجانب ، ويتألف من خلايا الظهارية المركزية فقط (م) (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الطبق الذي يحتوي على explants المركزي الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. تغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم ومرة واحدة مع من 1ml ، معايرتها الطازجة المتوسطة تعليق (37 درجة مئوية ثاني ، و 5 ٪ 2). هذه يغسل يقلل كثيرا من احتمال حدوث تلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2mL من مستنبت للحث على تمايز 1 ، ووضع explants في ترطيب والأنسجة حاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. قد فترات ثقافة تكون قصيرة بقدر بضع ساعات أو لتمديد طالما أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع ، اعتمادا على المعلمة التي تجري دراستها. وينبغي تغيير كل المتوسطة يومين إلى ثلاثة أيام. </li></ol> الجزء 4 : حصاد explants لتحليل الأحداث المرتبطة التمايز 1. حصاد explants لتحليل البروتين أو الحمض النووي الريبي المواد : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissecting ملاقط </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS الاحتياطي أو تحلل الحمض النووي الريبي في وقت لاحق. </li></ol> الإجراء : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية فترة الحضانة ، وإزالة ثقافة المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر ستيريو تشريح ، وتخفيف بلطف على حواف كل ازدراع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع كل يزدرع مع ملاقط وتحويلها إلى أنبوب يحتوي على نحو العازلة 100μl تحلل SDS (لتحليل البروتين) أو في وقت لاحق - RNA (الحمض النووي الريبي للتحليل). تستنهض الهمم غيض من ملاقط في الحل لضمان أن لا يزدرع التمسك ملاقط. </li></ol> 2. حصاد explants لالمناعي المواد والكواشف : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفوسفات مخزنة المالحة مع الكالسيوم والمغنيسيوم (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفوسفات مخزنة المالحة (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 ٪ بارافورمالدهيد (الاحيائية بوسطن ، ورسستر ، MA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissecting ملاقط </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسعور وسم القلم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرائح الزجاجية المجهر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.25 ٪ تريتون مخزنة X - 100 في الفوسفات المالحة. </li></ol> الإجراء : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف explants فترة وجيزة في برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأنسجة بإضافة بارافورمالدهيد 4 ٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تثبيتي ، واستبدال الفوسفات مخزنة المالحة. explants ثابتة تصبح قاسية نوعا ما ، مما يسمح لهم برفع ونقل إلى شرائح زجاجية للimmunostaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة صغيرة من برنامج تلفزيوني (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) على الشريحة للمساعدة في موقف الأنسجة ومنع الشباك. باستخدام الملقط microdissecting ، ورفع يزدرع وأدخله في الانخفاض على الشريحة. دون لمس يزدرع ، إزالة السائل بعناية مع فتيلة الورق إلى تسطيح يزدرع على الزجاج والسماح للنسيج في الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 5 دقائق. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الرقم (1) ألف وظهارة المحيطية عن تمايز بروتينات محددة. وكان immunostained يزدرع معروضة للN - كادهيرين مباشرة بعد microdissection. ويعتبر التعبير في مجموعة من الخلايا في البشرة المحيطة ، مشيرا إلى أن الخلايا الموجودة في هذه المنطقة قد بدأت في التفريق. باء يمكن أن خفضت وظهارة هامشية بعيدا لإزالة الخلايا التي تعبر عن N - كادهيرين وغيرها من تمايز بروتينات محددة. في الحلقة الأحمر يمثل الموقع من الخلايا التي تعبر عن N - كادهيرين ، في حين أن مربع صغير المبينة في الرمادي يمثل رباعي للظهارة 1A هو موضح في اللوحة. يمكن إزالة ظهارة الطرفية أربعة تخفيضات مشرط ، وترك الساحة المركزية التي تحتوي على الخلايا الوحيدة التي لم تبدأ بعد للتمييز.

<ol>
	<li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration.">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li><li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium.">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+(FGF).">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li><li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+major+intrinsic+protein+(MIP)/aquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling.">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li><li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation.">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+(ERK1/2)+signalling.">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li><li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene.">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li><li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6,+c-Maf,+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin.">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li><li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants.">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li></ol>

وقد تم ازدراع عدسة نظام الفئران المستخدمة بنجاح من قبل عدد من المختبرات لدراسة محطة تمايز الخلايا الظهارية للألياف العدسة عدسة 21،3،4،5. عندما تتعرض لجمعية جيل المستقبل - 2 في 100ng/ml سوف تبدأ explants لإظهار التغيرات في الإشارة في غضون دقائق 6 ، مع تغييرات في الشكل والتعبير الجيني التي تظهر تباعا على مدى عدة أيام 3،4،5. ثقافات تبقى قابلة للحياة لمدة 2-3 أسابيع إذا كان الحرص على منع التلوث. وexplants المركزية الموصوفة في هذا البروتوكول مفيدة بوجه خاص لدراسة تسلسل الأحداث المرتبطة تمايز ، لأنها تحتوي على بعض الخلايا التي وجدت التعبير عن علامات التمايز قبل FGF - 2 يضاف 1،5. ثم تمييز الخلايا بشكل متزامن ، وأتراب ، مما يجعل من الممكن لمتابعة دوام من الإشارات والأحداث المرتبطة الترانسكربتي التمايز. explants زراعة لفترات مختلفة من الوقت وبالتالي يوفر معلومات دقيقة عن الزماني للأحداث التسلسل. ويمكن إضافة مثبطات محددة إلى مستنبت ذات الصلة لتحديد مسارات الإشارات. يمكن استخدامها لتحليل التعبير Explants البروتين هلام إستشراد SDS وimmunoblotting أو لتحليل التعبير عن mRNAs محددة RT - PCR. بروتين غلة تتراوح 20-50 ميكروغرام / يزدرع والمحصول RNA هو حوالي 200 -- 600 نانوغرام / يزدرع ، تبعا لطول فترة الثقافة. عموما نجد أن explants 5-6 في صحن سيوفر البروتين كافية أو الحمض النووي الريبي لفحوصات عدة. ويمكن أيضا من الحمض النووي الريبي explants أن تستخدم لإعداد [كدنا] لتقييم التعبير الجيني عن طريق التحليل ميكروأري ، والتي يمكن تحديد جينات جديدة قد تكون حاسمة للتمايز. ويمكن أيضا أن تكون Explants transfected. على الرغم من كفاءة ترنسفكأيشن منخفضة عموما ، فإنه يكفي لمعايرة الجينات مراسل 4 و 7 و 8. المجهري المناعي للexplants يقدم إضافة مفيدة لأساليب الكيمياء الحيوية من خلال تحديد مكان التحت خلوية من البروتينات المثيرة للاهتمام. وبالتالي ، فإن إعداد وثقافة explants عدسة الفئران نظاما قويا لدراسة عدسة محطة تمايز في الثدييات ، والتي يمكن أن تكمل في تقنيات الحية ، مثل جيل من الفئران المعدلة وراثيا وضرب.

preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation

ويغطي السطح الأمامي للعدسة العين عن طريق أحادي الطبقة من الخلايا الطلائية ، والتي تتكاثر في منطقة الحلقي الكامنة في الجسم الهدبي. بعد التقسيم ، وهذه الخلايا تهاجر الخلف ، حيث نشرها جمعية جيل المستقبل من الشبكية يدفعهم للتمييز في مجموعة الخلفي ممدود من خلايا ألياف العدسة ، الذي يؤلف الجزء الأكبر من العدسة. يمكن أن يتسبب تمايز الخلايا الظهارية في ألياف العدسة عدسة في المختبر بواسطة explants زراعة في المنطقة الوسطى من الظهارة الأمامية في حضور FGF - 2. مستعدون Explants من العدسات من الفئران حديثي الولادة عن طريق إزالة العدسة من العين واستيعاب كبسولة العدسة على الجانب الخلفي مع ملاقط تشريح. ومن ثم الكبسولة الخلفي مزقتها بلطف فتح وضغط أسفل إلى أسفل من البلاستيك طبق نسيج الثقافة. يتم إزالة المناطق المحيطية من يزدرع مع مشرط ومثقف ثم المنطقة الوسطى في حضور 100ng/ml FGF - 2 لطالما 2-3 أسابيع ، اعتمادا على المعلمات لدراستها. منذ الخلايا الظهارية في explants مثقف التفريق في التزامن التقريبي على مدى أيام وأسابيع ، يمكن تحديد مسار وقت الإشارات والتعبير الجيني باستخدام التقنيات الجزيئية والكيمياء الحيوية والدوائية. المجهري المناعي هو مساعدا قويا إلى هذه الأساليب لأنها تدل على توطين التحت خلوية من البروتينات من الاهتمام ويمكن أن تكشف عن الآثار الفسيولوجية للتلاعب التجريبي لمسارات الإشارات.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation at JoVE.com

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Explants في المنطقة الوسطى من الفئران عدسة ظهائر التفريق بشكل متزامن عند تربيتها في حضور FGF - 2. يمكن المجهري المناعي من مثل هذه الثقافات يوفر معلومات حول رواية التعبير الجيني والأحداث المرتبطة يشير التمايز المحطة.

إعداد وثقافة Explants لنس الجرذ طلائي لدراسة التمايز الطرفية

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

preparation-culture-rat-lens-epithelial-explants-for-studying

Research

JoVE Journal

Biology

12.6K Views.  National Eye Institute (NEI), National Institutes of Health (NIH). Explants في المنطقة الوسطى من الفئران عدسة ظهائر التفريق بشكل متزامن عند تربيتها في حضور FGF - 2. يمكن المجهري المناعي من مثل هذه الثقافات يوفر معلومات حول رواية التعبير الجيني والأحداث المرتبطة يشير التمايز المحطة.

Video: Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

عضوي النمط من الثقافة شريحة أدمغة الفئران E18

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

الإنسان الشعبي الأساسي الخلايا الظهارية نمت من Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

نظام لخلايا الظهارية التثقيف صبغات قزحية عدسة لدراسة التجديد في نيوت

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

طريقة مبتكرة لثقافة الاستقطاب وتحفيز من explants الإنسان مخاطية الأمعاء

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

إعداد الجرذ مصل مناسب للالثدييات الجامع الثقافة الأجنة

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

الفيديو خالية من عدسة مجهرية للدينامية والتحليل الكمي للثقافة الخلية ملتصقة

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

العزلة ، تنقيه ، والتمايز من السلائف العظمية من نخاع العظم الفئران

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

عزل وإثراء الخلايا السلفية الظهارية للرئة البشرية للزراعة العضوية

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

دراسة شفط البروتين أثناء تطوير عدسة الدجاج

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of similarity with the human lens. RCAS(A) is a replication-competent chicken retrovirus that infects dividing cells, which serves as a powerful tool to study the in situ expression and function of wild-type and mutant proteins during lens development by microinjection into the empty lumen of lens vesicle at early developmental stages, restricting its action to surrounding proliferating lens cells. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus provides a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Specifically, targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters. In this article, we will briefly overview the steps needed for recombinant retrovirus RCAS(A) preparation, provide a detailed, comprehensive overview of the microinjection procedure, and provide sample results of the technique.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في تطوير العدسة ووظيفتها من خلال الحقن المجهري للفيروس القهقري RCAS (A) في عدسة الدجاج الجنينية 

This protocol paper describes the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) retrovirus as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development.

الحقن المجهري للفيروس القهقري RCAS (A) المؤتلف في عدسة الدجاج الجنينية

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...