La préparation des explants épithéliales du cristallin a été adaptée à partir des méthodes origine dans le laboratoire du Dr John McAvoy 9. Ce travail est financé par le National Eye Institute, Programme de recherche intra-muros Z01-EY000238-22

Partie 1: Retrait des lentilles Matériel et réactifs: <ol><li> Micro-dissection ciseaux, courbes, bouts arrondis, (tels as.RS-5983, Roboz instruments chirurgicaux Co., Inc, Gaithersburg, MD), les micro-dissection des pincettes, pointe recourbée (comme Roboz # RS5137). </li><li> Milieu de suspension: Milieu 199 contenant 0,1% d&#39;albumine sérique bovine, 100 unités / ml de pénicilline, la streptomycine 100μg/ml, 2,5 pg / ml d&#39;amphotéricine B. Réactifs sont disponibles chez Invitrogen, Carlsbad, CA. </li></ol> Procédure: <ol><li> Euthanasier les rats nouveau-nés (âgés de 2-4 jours), conformément aux directives fournies par le National Institutes of Health, Bethesda, MD. </li><li> Retirez les paupières avec des ciseaux chirurgicaux. Appuyez doucement avec des pinces courbées sur les côtés opposés de l&#39;orbite de l&#39;œil pour forcer l&#39;œil à gonfler vers l&#39;extérieur. Faire une petite incision sur le côté postérieur de l&#39;œil avec les ciseaux. En appuyant avec des pincettes contre le côté de l&#39;œil opposé de l&#39;incision, la lentille et une petite quantité de corps vitré fixé peut alors être forcé à travers la rupture, permettant à la lentille pour être ramassé avec des pincettes courbes. Il faut prendre soin de ne pas briser la capsule du cristallin. </li><li> Utilisez la pince à épiler courbée pour transférer les lentilles dans un plat en plastique 60mm tissus de culture contenant 5ml chaud, milieu de suspension stérile. </li></ol> Partie 2: Microdissection d&#39;explants Matériel et réactifs: <ol><li> Micro brucelles à dissection, 0,1 mm conseils, (comme Roboz RS-4976). Nous utilisons en alliage Dumostar raison de la flexibilité de la pointe, mais d&#39;autres alliages d&#39;acier sont aussi acceptables. Brucelles avec pointes plus mince que 0,1 mm ne sont pas recommandés, car ils ont tendance à casser ou plier lors de cette procédure. </li><li> Milieu de suspension (voir partie 1) </li><li> Non supplémenté milieu F12 de Ham ou Medium 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> Procédure: <ol><li> Les étapes suivantes devraient être effectuées dans un endroit propre, sans courant d&#39;environnement en utilisant des outils de dissection et stériles milieu stérile. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un microscope stéréoscopique, nettoyer les lentilles de tout tissu adhérant à la pointe de 0,1 mm et une pince à épiler les transférer à une boîte de culture contenant 5ml 60mm seconde milieu de suspension stérile (cette étape permet de réduire la contamination). Avec la pince à épiler, le transfert, le nombre souhaité de lentilles pour une boîte de culture contenant 35mm 5ml stérile, milieu non. (Nous utilisons souvent F12 de Ham (Invitrogen) pour cette étape, car la faible concentration de colorant rend la dissection plus facile, cependant, le milieu 199 est également acceptable Pas d&#39;antibiotiques ou autres ajouts sont nécessaires pendant cette étape..) Autant que 12 explants peuvent être faites dans le centre d&#39;un plat de cette taille. Toutefois, un plat de 35 mm doit être utilisé même si moins explants sont à faire, parce que les outils de dissection ne peut pas être manipulé facilement dans un petit plat. Transférer le plat contenant les lentilles restantes à un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient nécessaires. </li><li> Identifier la face postérieure de la lentille. Il ya plusieurs façons de reconnaître cela: 1) Le postérieur est plus ronde que l&#39;antérieure, qui est légèrement aplatie, 2) les lentilles rat nouveau-né sous forme de cataractes froid, car ils refroidir à température ambiante pendant la dissection. Si la cataracte froid n&#39;a pas complètement rempli l&#39;objectif, le côté postérieur est le côté le plus éloigné de la région opaque. Si l&#39;opacité a rempli l&#39;objectif, le réchauffement de la parabole à 37 ° C pendant quelques minutes sera l&#39;inverse. Le côté postérieur peuvent être identifiés comme les réformes de la cataracte au refroidissement. 3) Les vestiges de la tunique vasculosa lentis peuvent être visibles sur le côté postérieur. 4) La suture postérieure peut être visible sur le côté postérieur. Identifier correctement le côté postérieur est essentiel, car c&#39;est là que la capsule sera ouverte. Ouverture de la lentille sur la face antérieure va déchirer l&#39;épithélium. </li><li> Une fois le côté postérieur a été identifié, le tourner vers le haut et saisir la lentille dans la pince à gauche (pour un travailleur droitier). Puis pincer la capsule postérieure avec la pincette droit de produire un petit pli. </li><li> Tout en tenant la capsule postérieure avec la pince à épiler droite, saisir le pli de la capsule avec les pinces à gauche et tirez les deux paires de pinces à épiler dans des directions opposées pour faire une petite déchirure de la capsule. </li><li> Alors saisissant le bord de la capsule se rétracter à la pince à épiler, retirez la baisse, d&#39;abord sur un côté, puis de l&#39;autre, en le pressant dans le plastique de la boîte avec la pince à épiler. Répétez cette opération plusieurs fois, se déplaçant tout autour de l&#39;équateur de la lentille, jusqu&#39;à ce que la capsule est fermement attaché à la plaque en de nombreux points. Tenir la capsule en place avec les pinces à gauche, secouez légèrement la masse de fibres avec les pincettes droit de rompre l&#39;attachement entre les cellules des fibres et des cellules épithéliales à l&#39;équateur de l&#39;objectif. Puis poussez la masse de fibres de là, rouler hors de la capsule / épithélium, qui reste attaché au fond de laplat. Continuez ce processus avec toutes les lentilles dans le plat. Retirez et jetez les masses de fibres (ou les enregistrer congelés comme une source de protéines du cristallin pour les autres études). </li></ol> Partie 3: microdissection et de culture d&#39;explants centrale Matériel et réactifs: <ol><li> Stérile scalpel jetable, n ° 15 lame, (Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH) </li><li> Phosphate stérile saline tamponnée avec du calcium et du magnésium (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Milieu de culture: milieu de suspension contenant 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc St Louis, MO). </li></ol> Procédure: <ol><li> Avec un scalpel stérile, rogner l&#39;épithélium périphérique (PE), qui contient des cellules dans les premiers stades de la différenciation (figure 1A), laissant une place centrale d&#39;environ 2,0 mm sur un côté, composé de cellules épithéliales centrale uniquement (CE) (figure 1B). </li><li> Placer la capsule contenant les explants centrale à un cabinet de biosécurité. Laver 3 fois avec du PBS stérile contenant du calcium et de magnésium et une fois avec 1 ml de frais, milieu de suspension équilibrée (37 ° C CO, 5% 2). Ces lavages de réduire considérablement la probabilité de contamination. </li><li> Ajouter 2 mL de milieu de culture pour induire la différenciation 1, et le lieu des explants dans un incubateur humidifié, incubateur de culture tissulaire à 37 ° C, 5% de CO 2. Périodes de la culture peut être aussi courte que quelques heures ou de prolonger aussi longtemps que deux à trois semaines, en fonction du paramètre étudié. Milieu doit être changé tous les deux à trois jours. </li></ol> Partie 4: La récolte des explants pour l&#39;analyse des événements liés à une différenciation 1. Explants récolte pour l&#39;analyse de protéines ou d&#39;ARN Matériaux: <ol><li> Brucelles Microdissecting </li><li> SDS Lysis Buffer ou de l&#39;ARN-tard </li></ol> Procédure: <ol><li> A la fin de la période d&#39;incubation, éliminer le milieu de culture. </li><li> Utilisation du microscope stéréoscopique, détacher doucement les bords de chaque explant. </li><li> Soulevez chaque explant avec la pince à épiler et le transférer dans un tube contenant environ 100 ul de tampon de lyse SDS (pour l&#39;analyse des protéines) ou d&#39;ARN-tard (pour l&#39;analyse de l&#39;ARN). Agiter la pointe de la pince à épiler dans la solution pour s&#39;assurer que l&#39;explant ne colle pas à la pince à épiler. </li></ol> 2. Explants récolte pour immunofluorescence Matériel et réactifs: <ol><li> Tampon phosphate salin avec du calcium et du magnésium (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Tampon phosphate salin (sans calcium ni magnésium) (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Paraformaldéhyde à 4% (bioproduits Boston, Worcester, MA) </li><li> Brucelles Microdissecting </li><li> Hydrophobe marqueur </li><li> Lames de microscope </li><li> 0,25% de Triton X-100 en tampon phosphate salin. </li></ol> Procédure: <ol><li> Rincer brièvement les explants dans du PBS contenant du calcium et du magnésium. </li><li> Fixer les tissus en ajoutant paraformaldéhyde à 4% pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Retirer le fixateur et le remplacer par un tampon phosphate salin. Explants fixes deviennent un peu raide, leur permettant d&#39;être levé et transféré à lames de verre pour l&#39;immunocoloration. </li><li> Placer une petite goutte de PBS (sans calcium et magnésium) sur la diapositive pour aider à positionner le tissu et empêcher le curling. L&#39;aide de pincettes microdissecting, ascenseur de l&#39;explant et l&#39;insérer dans la goutte sur la lame. Sans toucher l&#39;explant, retirez soigneusement le liquide avec une mèche de papier pour aplatir l&#39;explant sur le verre et laissez le tissu sécher à l&#39;air à température ambiante pendant 3 à 5 minutes. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1 A. L&#39;épithélium périphériques exprime une différenciation des protéines spécifiques. L&#39;explant a été montré immunocolorées pour la N-cadhérine immédiatement après microdissection. L&#39;expression est vu dans une bande de cellules de l&#39;épithélium périphérique, ce qui indique que les cellules de cette région ont commencé à se différencier. B. L&#39;épithélium périphérique peut être coupé, pour supprimer les cellules qui expriment la N-cadhérine et d&#39;autres protéines spécifiques de différenciation. L&#39;anneau rouge représente l&#39;emplacement des cellules qui expriment la N-cadhérine, tandis que le petit carré décrites dans le quadrant grise représente de l&#39;épithélium montré dans le panneau 1A. L&#39;épithélium périphérique peut être enlevé par quatre coupes de scalpel, laissant une place centrale qui contient uniquement des cellules qui n&#39;ont pas encore commencé à se différencier.

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	<li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration.">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li><li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium.">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+(FGF).">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li><li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+major+intrinsic+protein+(MIP)/aquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling.">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li><li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation.">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+(ERK1/2)+signalling.">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li><li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene.">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li><li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6,+c-Maf,+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin.">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li><li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants.">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li></ol>

Le système explant rat lentille a été utilisé avec succès par un certain nombre de laboratoires pour étudier la différenciation terminale des cellules épithéliales du cristallin aux fibres optique 21,3,4,5. Lorsqu&#39;ils sont exposés à FGF-2 au 100ng/ml les explants va commencer à montrer les changements dans la signalisation dans les minutes 6, avec des changements dans la morphologie et l&#39;expression des gènes apparaissant séquentiellement sur ​​plusieurs jours 3,4,5. Les cultures restent viables pendant 2-3 semaines, si on prend soin d&#39;éviter toute contamination. Les explants centrale décrite dans ce protocole sont particulièrement utiles pour l&#39;étude de la séquence des événements associés à la différenciation, car ils contiennent peu ou pas de cellules qui expriment des marqueurs de différenciation, avant le FGF-2 est ajouté 1,5. Les cellules se différencient ensuite synchrone, comme une cohorte, ce qui permet de suivre l&#39;évolution temporelle de la signalisation et les événements transcriptionnels associés à la différenciation. Explants de culture différentes longueurs de temps fournit donc des informations précises sur les événements temporels séquence. Des inhibiteurs spécifiques peuvent être ajoutés au milieu de culture afin d&#39;identifier les voies de signalisation pertinente. Explants peuvent être utilisés pour analyser l&#39;expression des protéines par électrophorèse sur gel SDS et immunoempreinte ou pour analyser l&#39;expression des ARNm spécifiques par RT-PCR. Protéines rendements large de 20 à 50 mg / explant et le rendement en ARN est d&#39;environ 200 à 600 ng / explant, selon la longueur de la période de culture. En général, nous constatons que 5-6 explants par boite fournira suffisamment de protéines ou d&#39;ARN pour des essais de plusieurs années. ARN à partir d&#39;explants peut également être utilisé pour préparer l&#39;ADNc pour évaluer l&#39;expression des gènes par l&#39;analyse des microréseaux, qui permet d&#39;identifier de nouveaux gènes qui peuvent être cruciaux pour la différenciation. Explants peuvent également être transfectées. Bien que l&#39;efficacité de la transfection est généralement faible, il est suffisant pour le dosage de gènes rapporteurs 4, 7, 8. Immunofluorescence des explants fournit un complément utile à des méthodes biochimiques, en déterminant la localisation subcellulaire des protéines d&#39;intérêt. Ainsi, la préparation et à la culture d&#39;explants lentilles rat fournit un système puissant pour l&#39;étude de différenciation terminale optique chez les mammifères, ce qui peut compléter des techniques in vivo, comme la génération de souris transgéniques et knock-out.

preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation

La surface antérieure de la lentille oculaire est recouverte par une monocouche de cellules épithéliales, qui prolifèrent dans une zone annulaire sous le corps ciliaire. Après la division, ces cellules migrent arrière, où la diffusion de la rétine FGF induit à se différencier dans un tableau postérieure de cellules allongées en fibres optique, qui composent le gros de la lentille. La différenciation des cellules épithéliales du cristallin en fibres lentille peut être induite in vitro par des explants en culture de la région centrale de l&#39;épithélium antérieur, en présence de FGF-2. Les explants sont préparés à partir des lentilles de rats nouveau-nés en enlevant le cristallin de l&#39;œil et de saisir la capsule du cristallin sur la face postérieure avec des pincettes dissection. La capsule postérieure est déchirée puis doucement ouvert et enfoncé dans le fond d&#39;un plat en plastique culture de tissus. Les régions périphériques de l&#39;explant sont enlevés avec un scalpel et la zone centrale est ensuite mis en culture en présence du FGF-2 100ng/ml aussi longtemps que 2-3 semaines, selon les paramètres à étudier. Comme les cellules épithéliales de différencier les explants cultivés en synchronie approximative sur une période de quelques jours ou semaines, le cours du temps de la signalisation et l&#39;expression des gènes peut être déterminé en utilisant des techniques moléculaires, biochimiques et pharmacologiques. Immunofluorescence est un complément puissant à ces méthodes, car elle démontre la localisation subcellulaire des protéines d&#39;intérêt et peuvent révéler les conséquences physiologiques de manipulations expérimentales des voies de signalisation.

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Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Des explants de la région centrale du cristallin chez le rat l&#39;épithélium de différencier de manière synchrone lorsque cultivées en présence de FGF-2. Microscopie par immunofluorescence de ces cultures peut fournit des informations roman sur l&#39;expression des gènes et des événements de signalisation associées à la différenciation terminale.

Préparation et de la culture d&#39;explants Objectif Rat épithéliales pour l&#39;étude de la différenciation terminale

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

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Research

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Biology

12.6K vues.  National Eye Institute (NEI), National Institutes of Health (NIH). Des explants de la région centrale du cristallin chez le rat l'épithélium de différencier de manière synchrone lorsque cultivées en présence de FGF-2. Microscopie par immunofluorescence de ces cultures peut fournit des informations roman sur l'expression des gènes et des événements de signalisation associées à la différenciation terminale.

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Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Culture organotypique des cerveaux de rat E18

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Recherche

Biologie

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primaire cellules épithéliales bronchiques humaines Cultivé à partir d&#39;explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un système de culture de cellules épithéliales de l&#39;iris Pigment étudier la régénération Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

Une nouvelle méthode pour la Culture et polarisé stimulation des explants de muqueuse intestinale de l&#39;homme

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Préparation du Rat Serum Convient pour la culture d&#39;embryons de mammifères entier

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

La microscopie vidéo sans lentille pour la dynamique et l’analyse Quantitative de la Culture de cellules adhérentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Isolement, purification et différenciation des précurseurs d’Ostéoclast de la moelle osseuse de rat

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolement et enrichissement des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires humaines pour la culture organoïde

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Étude de l’expression des protéines au cours du développement du cristallin de poulet

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of similarity with the human lens. RCAS(A) is a replication-competent chicken retrovirus that infects dividing cells, which serves as a powerful tool to study the in situ expression and function of wild-type and mutant proteins during lens development by microinjection into the empty lumen of lens vesicle at early developmental stages, restricting its action to surrounding proliferating lens cells. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus provides a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Specifically, targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters. In this article, we will briefly overview the steps needed for recombinant retrovirus RCAS(A) preparation, provide a detailed, comprehensive overview of the microinjection procedure, and provide sample results of the technique.

Pleins feux sur l’auteur : Étude du développement et de la fonction du cristallin par micro-injection de rétrovirus RCAS(A) dans le cristallin embryonnaire de poulet 

This protocol paper describes the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) retrovirus as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development.

Micro-injection d’un rétrovirus RCAS(A) recombinant dans une lentille embryonnaire de poulet

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...