I. El NanoDrop 2000c Espectrofotómetro Tecnología NanoDrop se basa en un sistema de retención de la muestra innovadora que utiliza la tensión superficial para mantener y medir muestras microvolumen entre dos pedestales ópticas sin el uso de cubetas o capilares. El NanoDrop 2000c espectrofotómetro utiliza esta tecnología para medir rápida y fácilmente las gotas de 0,5-2 l de proteínas, ADN, el ARN y otras biomoléculas. Esta capacidad se ha convertido cada vez más importante como las técnicas moleculares evolucionan continuamente a utilizar pequeñas cantidades de material para el análisis. El ideal espectrofotómetro microvolumen de condiciones en las que la muestra es limitado. Sin embargo, la facilidad de uso, el ciclo de medición rápida y extensa gama de concentración y también hacen que el espectrofotómetro adecuado, cuando grandes cantidades de muestra están disponibles. El ciclo de medición también es reducido en gran medida, ayudando a los científicos aumentar la eficiencia a través de sus flujos de trabajo. El micromuestra se coloca directamente en la parte superior de la superficie de detección y una columna de líquido se crea entre los extremos de las fibras ópticas por la tensión superficial. Esta columna de líquido forma un camino óptico vertical. Un flash de xenón lámpara proporciona la fuente de luz y un espectrómetro de la utilización de una matriz CCD se utiliza para analizar la luz que pasa a través de la muestra. La eliminación de los dispositivos tradicionales de contención tales como cubetas del sistema tiene varias ventajas: cantidades muy pequeñas de muestra son necesarios para la medición, la limpieza requiere simplemente limpiar las superficies ópticas con un laboratorio de limpiar, y la longitud del camino se pueden cambiar en tiempo real durante la medición. El 2000c NanoDrop determina la longitud del camino óptimo de forma automática (1 mm y 0,05 mm), proporcionando la más amplia gama de posibles mediciones de concentración de proteínas sin diluciones. Al acortar la longitud del camino, la mayor concentración de proteínas se puede medir. Esto elimina la necesidad de realizar las diluciones de las muestras más proteínas. Por ejemplo, el 2000c NanoDrop puede medir las concentraciones de BSA de hasta 400 mg / mL. El NanoDrop 2000c espectrofotómetro es un espectrofotómetro de espectro completo para medir la absorción de ADN, el ARN, proteínas y otras biomoléculas. Este protocolo de vídeo se centrará en la medición de las proteínas. II. Concentración de proteínas microvolumen determinación usando mediciones de absorbancia A280 a. Principio de las mediciones A280 El método A280 proteína es aplicable a las proteínas purificadas que contienen triptófano, los residuos de tirosina, fenilalanina o cisteína, enlaces disulfuro y la absorbencia muestra a 280 nm. Este método utiliza el valor de absorbancia A280 en combinación con el coeficiente de extinción en masa o el coeficiente de extinción molar para calcular la concentración de la proteína purificada. La ventaja de las mediciones directas A280 es que la generación de una curva patrón no está obligado a determinar la concentración de proteína. Si la muestra es una solución de proteína no caracterizada, lisado de células, o extracto de proteína cruda, a continuación, utilizando uno de los métodos colorimétricos preconfigurados disponibles en el 2000/2000c NanoDrop, como BCA, Pierce 660 nm, Bradford, Lowry y los ensayos, es recomienda. b. Microvolumen proteína A280 Medidas - Inicio <ol><li> Seleccione la aplicación A280 de proteínas en el menú principal. </li><li> Seleccione el tipo de muestra a analizar de la lista desplegable. La configuración por defecto se recomienda para la mayoría de mezclas de proteínas desconocidas en el que una Abs = 1 mg / ml. Si la medición de una proteína previamente caracterizada purificada, o bien el coeficiente de extinción en masa o coeficiente de extinción molar y el peso molecular puede ser ingresado para determinar la concentración de proteínas con mayor precisión. </li><li> Elija las unidades de concentración de la lista desplegable. </li></ol> c. Microvolumen y proteínas A280 - Supresión <ol><li> Establecer un blanco con un tampón apropiado. Es importante utilizar el buffer en el que se suspende la proteína. El tampón utilizado debe ser el mismo pH y de una fuerza similar iónicos como la solución de la muestra. Nota: buffers RIPA absorbancia contribuir mucho a 280 nm y por lo tanto, incompatible con las mediciones directas A280 proteínas. Para las proteínas en suspensión en un tampón RIPA, se recomienda la concentración de proteínas se determinó utilizando un buffer RIPA ensayo colorimétrico compatible. </li><li> Pipetear 2 l de la solución apropiada de cierre en la parte inferior del pedestal, bajar el brazo y haga clic en blanco. </li><li> Limpie la solución en blanco de los pedestales superior e inferior con un laboratorio de limpieza en seco. </li></ol> d. Microvolumen y proteínas A280 de medición Consideraciones importantes: La homogeneidad de la muestra es muyimportante, ya que un volumen tan pequeño que se está midiendo. Para asegurar que las muestras son homogéneas, suavemente pero a fondo la mezcla de las muestras inmediatamente antes de tomar una alícuota para la medición. Evitar la introducción de burbujas durante el mezclado y la pipeta. Debido a la variabilidad de la tensión superficial entre las proteínas diferentes, le recomendamos que cargue 2 l de las muestras para asegurar la formación adecuada columna. Utilice siempre puntas de pipeta de baja retención. Para cargar una muestra, toque la punta de la pipeta a la superficie del pedestal óptica inferior, mientras que la expulsión de la solución para evitar que la solución se adhiera a la parte exterior de la punta de la pipeta. Expulsar a menos que el monto total de la muestra para evitar que escape y la introducción de burbujas en la muestra. <ol><li> Introduzca una identificación de la muestra en el campo apropiado, carga de 2 l de la primera muestra como se describe en la medida en blanco y haga clic en. Una alícuota de la muestra 2μL se debe utilizar para cada medición. </li><li> Retire la muestra de los pedestales superior e inferior con un laboratorio de limpieza en seco. </li></ol> e. Microvolumen proteína A280 Medidas de limpieza Una ordinaria y sin pelusa, limpie de laboratorio a menudo es suficiente para la limpieza de los pedestales óptica entre las mediciones. f. Hacer proteína A280 Medidas de reacondicionamiento Soluciones y reactivos que contienen surfactantes pueden sin condiciones de las superficies del pedestal de medición a través del tiempo, la prevención de la columna de líquido de la muestra a la forma. Un aplanamiento de la gota en el pedestal más bajo es indicativo de la superficie óptica convirtiendo incondicionado. Si las propiedades de superficie han sido comprometidos, reacondicionamiento de los pedestales es importante para asegurar la formación de la muestra de la columna. Si esto ocurre, aficionado a las superficies ópticas con fuerza el uso de laboratorio o eliminar el uso de pedestal compuesto NanoDrop reacondicionamiento (PR-1) como se indica. III. Concentración de proteínas microvolumen determinación sobre ensayos colorimétricos a. Principio de detección colorimétrica El espectrofotómetro NanoDrop 2000c también se puede utilizar para medir caracterizados soluciones de proteínas, lisados ​​celulares, y los extractos de proteína cruda mediante ensayos colorimétricos. Los métodos colorimétricos son métodos indirectos que implican la interacción de un medio de contraste con el componente de las proteínas de la muestra para producir un nuevo complejo que absorbe la luz en el rango de longitudes de onda visibles. El espectrofotómetro NanoDrop 2000c tiene varios pre-configurados ensayos colorimétricos como BCA, Pierce 660, Bradford, y los métodos de Lowry. El ensayo de BCA se demostrará como un ensayo colorimétrico ejemplo usando un espectrofotómetro microvolumen. (Screenshot) El BCA (ácido bicinconínico) ensayo es un método común colorimétrico de uso frecuente para las soluciones de proteínas diluidas y las proteínas en la presencia de componentes que han UV significativa (280 nm) la absorbancia. A diferencia del método A280 de proteínas, el método de BCA Protein requiere que una curva estándar se genera antes de que las concentraciones de la proteína de la muestra se puede medir. El método utiliza el ácido bicinchoninic (BCA) como reactivo de detección. El quelato Cu-BCA se formaron en presencia de la proteína se mide a 562 nm y normalizado a 750 nm. b. Microvolumen ensayo BCA mediciones BCA ensayo de preparación <ol><li> Los componentes necesarios están contenidos en el kit de agente reductor compatible (Thermo Scientific Pierce gato no 23250..): BCA reactivo A, B BCA reactivo, el reactivo de compatibilidad, la reconstitución de amortiguación, y la albúmina (BSA) las normas. </li><li> Equilibrar todas las proteínas desconocidas y las normas de la proteína a la temperatura ambiente y mezclar bien. </li><li> Prepare suficiente reactivo nuevo trabajo de los estándares y las muestras que se midió utilizando una proporción de 50:1 de reactivo A: B </li><li> Para el ensayo de micro, utilice una proporción de 1:1 de reactivo de trabajo a la muestra. Añadir 10 l de reactivo de trabajo a cada tubo con tubos lo suficiente para cubrir todas las muestras y estándares. Para el ensayo de alto rango, utilice una proporción de 20:1 de reactivo de trabajo a la muestra. Añadir 190 l de reactivo de trabajo a cada tubo con tubos lo suficiente para cubrir todas las muestras y estándares. Se refieren a la Pierce BCA kit literatura para determinar la relación es adecuada para sus muestras. </li><li> Añadir 10 l de estándar o muestra a cada tubo con el reactivo. Mezclar bien por agitación suave. </li><li> Incubar los tubos a 37 ° C durante 30 minutos. </li><li> Permiten que las reacciones estén a temperatura ambiente (~ 10 minutos). </li></ol> c. Microvolumen BCA Las mediciones del ensayo La generación de la curva estándar <ol><li> Seleccione el método de BCA Protein desde el menú principal. Si la ventana de verificación de la longitud de onda aparece, asegúrese que el brazo hacia abajo. </li><li> Introduzca los valores para cada concentración de patrón en la mesa panel de la derecha. El software permite la referencia y adic hasta 7normas ional. La referencia y / o las normas se debe medir en repeticiones. Nota: El requisito mínimo para la generación de la curva estándar es la medida de dos normas o la medición de la referencia estándar de cero y al menos uno. Se recomienda que las normas adicionales se incluye como necesario para cubrir el rango del ensayo concentración esperada. </li><li> Establecer un espacio en blanco. El espacio en blanco para los ensayos colorimétricos generalmente desionizada H 2 O. </li><li> Pipetear 2 l de dH 2 O en el pedestal inferior, baja el brazo y haga clic en blanco. Un testigo sólo es necesario para cubrir todas las mediciones posteriores de la referencia y las normas. </li><li> Establecer la referencia con la pipeta una alícuota de 2 l que contiene sólo reactivo de trabajo y el tampón con ninguna proteína en el pedestal inferior. Baje el brazo y la medida haga clic. </li><li> En la ficha Normas, seleccione el nivel deseado y l pipeta 2 de la norma que desee en el pedestal inferior. Baje el brazo y la medida haga clic. Repita el proceso para todos los niveles. Asegúrese de medir todas las normas anteriores a la medición de las muestras. Para ver la curva de calibración haga clic en Ver la curva estándar. </li></ol> d. Microvolumen BCA mediciones Ensayo 2 y proteínas l <ol><li> Después de todas las normas se han medido, haga clic en el botón de muestras. Introduzca la identificación de la muestra. Carga de 2 l de la muestra en el pedestal inferior y haga clic en Medida. Un fresco 2 l alícuota de la muestra se debe utilizar para cada medición. </li><li> Limpie la muestra de los pedestales superior e inferior con un laboratorio de limpieza en seco. </li></ol> e. Microvolumen mediciones de ensayo BCA Limpieza y Reacondicionamiento Realizar la limpieza y el reacondicionamiento como se describe en las mediciones de absorbancia directa A280. Los resultados representativos: Microvolumen determinación de la concentración de proteínas se lleva a cabo ya sea por un A280 de medición directa o indirecta de un ensayo colorimétrico. En el ejemplo de la medición A280 determina la concentración de proteínas basado en el coeficiente de extinción de la proteína de interés. En el ejemplo de BCA ensayo colorimétrico que determina la concentración de proteínas basado en una curva estándar de las concentraciones de proteína conocida.

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	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

The authors are employees of Thermo Fisher Scientific that produces reagents and tools used in this article.

Cuantificación microvolumen utiliza las propiedades de la superficie de la tensión intrínseca de una muestra para formar una columna de líquido entre dos superficies de medición. La ausencia de un dispositivo de contención, permite a la longitud del camino para cambiar en tiempo real, básicamente eliminando la necesidad de realizar diluciones. Esta capacidad aumenta considerablemente el rango dinámico de las concentraciones de proteínas, así como la velocidad de medición. Mediante el uso de cantidades mínimas de muestra, un gran número de muestras pueden ser analizadas de forma rápida y precisa, permitiendo a los científicos para tomar más medidas y lograr un mejor control de calidad. Además, y si es necesario, las muestras de preciosos pueden ser recuperados después de tomar una medida. Cuando tales volúmenes pequeños se están midiendo, homogeneidad de la muestra es muy importante para evitar errores de muestreo. Puntas de pipeta de baja retención siempre se debe utilizar para cargar las muestras y las puntas se debe cambiar entre la muestra repeticiones. Las superficies de pedestal debe ser limpiado y acondicionado para asegurar los resultados más precisos. Por último, el espectrofotómetro microvolumen es ideal cuando la muestra es limitado, sin embargo, la facilidad de uso, velocidad y amplia gama dinámica del espectrómetro lo hacen adecuado cuando la muestra es abundante.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory wipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>23250</td>
<td>Reducing agent compatible</td>
</tr>
<tr>
<td>PR-1 Reconditioning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

Espectrofotometría tradicional requiere la colocación de muestras en cubetas o capilares. Esto a menudo es poco práctico debido a los volúmenes de muestra limitada de uso frecuente para el análisis de proteínas. El Thermo Scientific NanoDrop 2000c Espectrofotómetro resuelve este problema con un sistema de muestra de retención innovadores que contiene muestras microvolumen entre dos superficies de medición utilizando las propiedades de tensión superficial de los líquidos, lo que permite la cuantificación de las muestras en volúmenes tan bajos como 0.5 a 2 l. La eliminación de las cubetas o capilares permite cambios en tiempo real en la longitud del camino, lo que reduce el tiempo de medición mientras aumenta el rango dinámico de las concentraciones de proteínas que pueden ser medidos. La necesidad de diluciones también se elimina, y los preparativos para la cuantificación de la muestra es relativamente fácil ya que las superficies de medición puede ser simplemente borrado con el laboratorio de limpiar. En este artículo de vídeo presenta modificaciones a los métodos tradicionales de determinación de la concentración de proteínas para la cuantificación de las cantidades de la proteína usando microvolumen A280 lecturas de absorbancia o el ensayo colorimétrico BCA.

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolumen muestras se han cuantificado mediante un sistema que utiliza un espectrofotómetro tensión superficial natural de retener las muestras sin el uso de cubetas o capilares. El rango dinámico de las concentraciones de proteínas y la velocidad con la que pueden ser medidos son mucho mayores con este método.

Concentración de proteínas microvolumen Determinación mediante el NanoDrop 2000c Espectrofotómetro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

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microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Research

JoVE Journal

Biology

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Video: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Investigación

Biología

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

La importancia de la concentración de la proteína correcta para la cinética y la determinación de afinidad en el análisis de la estructura-función

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

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Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinación del tejido Con el trasplante de Cap Animal (ACT) en el ensayo Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

La cuantificación de ADN de doble cadena con el Hitachi F-7000 espectrofotómetro de fluorescencia y Dye PicoGreen

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinación de la concentración de ácidos nucleicos y proteínas utilizando el micro-volumen Bio-spec Espectrofotómetro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinación de las interacciones proteína-ligando Uso diferencial de barrido Fluorimetría

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Concentración de proteínas microvolumen Determinación mediante el NanoDrop 2000c Espectrofotómetro

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