I. Le NanoDrop 2000c Spectrophotomètre La technologie NanoDrop est basé sur un système de rétention d&#39;échantillon innovant qui utilise la tension de surface de détenir et de mesurer des échantillons microvolume entre deux socles optique sans l&#39;utilisation des cuvettes ou des capillaires. Le NanoDrop 2000c spectrophotomètre utilise cette technologie pour mesurer rapidement et facilement de 0,5 à 2 gouttes uL de protéines, ADN, ARN, et d&#39;autres biomolécules. Cette capacité est devenu plus important que les techniques moléculaires évoluent continuellement à utiliser de plus petites quantités de matériel pour l&#39;analyse. L&#39;idéal pour le spectrophotomètre microvolume conditions dans lesquelles l&#39;échantillon est limité. Cependant, la facilité d&#39;utilisation, cycle de mesure rapide et, et gamme de concentration importante aussi faire le spectrophotomètre approprié lorsque des quantités suffisantes de l&#39;échantillon sont disponibles. Le cycle de mesure est également fortement réduite, aidant les scientifiques d&#39;accroître l&#39;efficacité tout au long de leur flux de travail. Le microéchantillon est placé directement sur le dessus de la surface de détection et une colonne de liquide est créée entre les extrémités des fibres optiques par la tension de surface. Cette colonne liquide forme un chemin optique vertical. Un flash au xénon lampe fournit la source de lumière et d&#39;un spectromètre utilisant une matrice linéaire CCD est utilisée pour analyser la lumière qui traverse l&#39;échantillon. Retrait de dispositifs de confinement traditionnels tels que les cuves du système a plusieurs avantages: très petites quantités d&#39;échantillons sont nécessaires pour la mesure, le nettoyage nécessite simplement en essuyant les surfaces optiques avec un laboratoire essuyer, et la longueur du chemin peuvent être modifiés en temps réel pendant la mesure. La 2000c NanoDrop détermine la longueur du chemin optimal automatique (1 mm à 0,05 mm), offrant la gamme la plus étendue possible des mesures de concentration en protéines sans dilutions. En raccourcissant la longueur du chemin, des concentrations plus élevées de la protéine peut être mesurée. Ceci supprime le besoin d&#39;effectuer des dilutions des échantillons de plus de protéines. Par exemple, le 2000c NanoDrop peut mesurer les concentrations de BSA aussi élevées que 400 mg / mL. Le spectrophotomètre NanoDrop 2000c est un spectrophotomètre spectre complet pour mesurer l&#39;absorbance de l&#39;ADN, ARN, protéines, et d&#39;autres biomolécules. Ce protocole vidéo mettra l&#39;accent sur la mesure des protéines. II. Détermination microvolume concentration de protéines utilisant A280 mesures d&#39;absorbance a. Principe de Mesures A280 La méthode A280 protéine purifiée est applicable à des protéines qui contiennent du tryptophane, la tyrosine, phénylalanine ou résidus des liaisons disulfure cystéine-cystéine et l&#39;absorbance d&#39;exposition à 280 nm. Cette méthode utilise la valeur d&#39;absorbance A280 en combinaison avec soit le coefficient d&#39;extinction de masse ou le coefficient d&#39;extinction molaire pour calculer la concentration de la protéine purifiée. L&#39;avantage de mesures directes A280 est que la génération d&#39;une courbe standard n&#39;est pas nécessaire pour déterminer la concentration de protéines. Si l&#39;échantillon est une solution de protéines non caractérisées, lysat cellulaire, ou de l&#39;extrait de protéine brute, puis en utilisant l&#39;une des méthodes pré-configuré colorimétrique disponible sur le 2000/2000c NanoDrop, tels que BCA, Pierce 660 nm, Bradford, Lowry et des essais, est recommandée. b. Microvolume protéines A280 Mesures - Démarrage <ol><li> Sélectionnez l&#39;application A280 de protéines à partir du menu principal. </li><li> Sélectionnez le type d&#39;échantillon à mesurer à partir de la liste déroulante. Le réglage par défaut est recommandé pour la plupart des mélanges de protéines inconnues dans lequel une Abs = 1 mg / mL. Si la mesure d&#39;une protéine purifiée précédemment caractérisé, alors soit le coefficient d&#39;extinction de masse ou le coefficient d&#39;extinction molaire et le poids moléculaire peut être saisi pour déterminer la concentration en protéines, plus précisément. </li><li> Choisissez les unités de concentration de la liste déroulante. </li></ol> C. Mesures microvolume A280 protéines - Blanking <ol><li> Établir une vierge à l&#39;aide d&#39;un tampon approprié. Il est important d&#39;utiliser le tampon dans lequel la protéine est suspendu. Le tampon utilisé doit être le même pH et d&#39;une force similaire ioniques comme la solution de l&#39;échantillon. Remarque: tampons RIPA contribuent absorbance trop à 280 nm et sont donc incompatibles avec les mesures directes de protéines A280. Pour les protéines en suspension dans un tampon RIPA, il est recommandé de concentration en protéines est déterminée en utilisant un tampon RIPA test colorimétrique compatibles. </li><li> Pipeter 2 ul de la solution appropriée d&#39;obturation sur le socle en bas, abaisser le bras et cliquez sur Blank. </li><li> Essuyez la solution à blanc par les piédestaux inférieure et supérieure à l&#39;aide d&#39;un laboratoire chiffon sec. </li></ol> d. Mesures microvolume A280 protéines de mesure Des considérations importantes: L&#39;homogénéité de l&#39;échantillon est extrêmementimportant, car un si petit volume est mesuré. Afin de s&#39;assurer que les échantillons sont homogènes, doucement mais bien mélanger les échantillons immédiatement avant de prendre une aliquote pour la mesure. Évitez d&#39;introduire des bulles lors du mélange et de pipetage. En raison de la variabilité de la tension de surface entre les différentes protéines, nous recommandons de charger 2 ul d&#39;échantillons afin d&#39;assurer la formation de la colonne appropriée. Toujours utiliser des embouts de pipette à faible rétention. Pour charger un échantillon, toucher la pointe de la pipette sur la surface inférieure piédestal optique tout en expulsant la solution pour empêcher la solution d&#39;adhérer à l&#39;extérieur de la pointe de la pipette. Expulser moins que le montant total de l&#39;échantillon afin de prévenir des explosions et l&#39;introduction de bulles dans l&#39;échantillon. <ol><li> Entrez un ID d&#39;échantillon dans le champ approprié, charge 2 pl de l&#39;échantillon d&#39;abord comme décrit pour la mesure de vide et cliquez sur. Une aliquote fraîche 2μL de l&#39;échantillon doit être utilisé pour chaque mesure. </li><li> Retirer l&#39;échantillon de l&#39;socles inférieurs et supérieurs à l&#39;aide d&#39;un laboratoire chiffon sec. </li></ol> e. Microvolume protéines A280 Mesures de nettoyage Une ordinaires, non pelucheux, essuyez-laboratoire est souvent suffisant pour le nettoyage des socles optiques entre les mesures. f. Faire protéines A280 Mesures Reconditionnement Solutions et réactifs contenant des tensioactifs peuvent incondition les surfaces piédestal de mesure au fil du temps, la prévention de la colonne liquide de l&#39;échantillon pour former. Un aplatissement de la goutte sur la partie inférieure du socle est indicative de la surface optique de devenir inconditionnée. Si les propriétés de surface ont été compromis, le reconditionnement des socles est important pour assurer la formation de colonne de l&#39;échantillon. Si cela se produit, polir la surface optique énergiquement à l&#39;aide de laboratoire ou de l&#39;utilisation essuyez composé piédestal NanoDrop reconditionnement (PR-1) comme indiqué. III. Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant des analyses colorimétriques a. Principe de détection colorimétrique Le spectrophotomètre NanoDrop 2000c peut également être utilisé pour mesurer les solutions de protéines non caractérisées, des lysats cellulaires, et des extraits de protéines brutes en utilisant des dosages colorimétriques. Les méthodes colorimétriques sont des méthodes indirectes qui impliquent une interaction d&#39;un colorant avec le composant protéique de l&#39;échantillon pour produire un nouveau complexe qui absorbe la lumière dans les longueurs d&#39;onde visibles. Le spectrophotomètre NanoDrop 2000c a plusieurs pré-configuré essais colorimétriques dont BCA, Pierce 660, Bradford, Lowry et méthodes. Le test BCA sera démontré comme un dosage colorimétrique par exemple à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre microvolume. (Screenshot) Le BCA (acide bicinchoninique) dosage est une méthode commune colorimétrique souvent utilisé pour des solutions de protéines diluées et des protéines dans la présence de composants qui ont UV significative (280 nm) d&#39;absorbance. Contrairement à la méthode A280 protéines, la méthode de protéines BCA nécessite que d&#39;une courbe standard être générés avant concentrations de protéines de l&#39;échantillon peut être mesurée. La méthode utilise l&#39;acide bicinchoninique (BCA) comme réactif de détection. Le chélate Cu-BCA formés en présence de la protéine est mesurée à 562 nm et normalisé à 750 nm. b. Microvolume dosage BCA Assay Mesures de préparation BCA <ol><li> Les réactifs nécessaires sont contenues dans le kit agent réducteur compatible (Thermo Scientific Pierce chat ne 23250..): Réactif BCA A, B réactif BCA, réactif compatibilité, le tampon de reconstitution, et l&#39;albumine (BSA) aux normes. </li><li> Equilibrer tous les protéines inconnues et les normes de protéines à température ambiante et bien mélanger. </li><li> Préparer le réactif de travail assez fraîche pour les normes et les échantillons à être mesurée en utilisant un ratio de 50:1 de réactif A: B </li><li> Pour le dosage de micro, utilisez un rapport de 1:1 de réactif de travail à l&#39;échantillon. Ajouter 10 uL de travailler réactif pour chaque tube avec des tubes assez pour couvrir tous les échantillons et les normes. Pour le dosage de haute gamme, utiliser un ratio de 20:1 du réactif de travail à l&#39;échantillon. Ajouter 190 ul de réactif de travail dans chaque tube avec des tubes assez pour couvrir tous les échantillons et les normes. Se référer à la littérature Pierce BCA kit afin de déterminer laquelle le rapport est adapté à vos échantillons. </li><li> Ajouter 10 uL d&#39;étalon ou d&#39;échantillon dans chaque tube contenant le réactif. Bien mélanger en douceur vortex. </li><li> Incuber les tubes à 37 ° C pendant 30 minutes. </li><li> Autoriser les réactions à s&#39;équilibrer à température ambiante (~ 10 minutes). </li></ol> C. Mesures microvolume dosage BCA Génération courbe standard <ol><li> Sélectionnez la méthode BCA protéine à partir du menu principal. Si la fenêtre de vérification de longueur d&#39;onde apparaît, s&#39;assurer que le bras est vers le bas. </li><li> Entrez les valeurs pour chaque concentration de l&#39;étalon dans le tableau volet de droite. Le logiciel permet pour la référence et jusqu&#39;à 7 additnormes ional. La référence et / ou des normes devrait être mesuré en répétitions. Remarque: L&#39;exigence minimale pour la génération de la courbe standard est la mesure de deux normes ou la mesure de la référence zéro et au moins un standard. Il est recommandé que les normes supplémentaires seront inclus comme nécessaire pour couvrir la fourchette de dosage devrait concentration. </li><li> Établir un vide. Le blanc pour les dosages colorimétriques sont généralement déminéralisée H 2 O. </li><li> Pipeter 2 pi de dH 2 O sur le socle en bas, abaisser le bras et cliquez sur Blank. Seule une vierge est nécessaire pour couvrir toutes les mesures ultérieures de la référence et les normes. </li><li> Établir la référence à la pipette une partie aliquote de 2 pl contenant uniquement un réactif de travail et de tampon avec aucune protéine sur la partie inférieure piédestal. Abaissez le bras et Mesure clic. </li><li> Sous l&#39;onglet Standards, sélectionnez le niveau souhaité et la pipette 2 ul de la norme souhaitée sur la partie inférieure piédestal. Abaissez le bras et Mesure clic. Répétez le processus pour toutes les normes. Soyez sûr de mesurer toutes les normes antérieures à des échantillons de mesure. Pour voir la courbe standard cliquez sur Afficher la courbe standard. </li></ol> d. Mesures microvolume dosage BCA 2 mesures de protéines uL <ol><li> Après que toutes les normes ont été mesurées, cliquez sur le bouton échantillons. Entrez l&#39;ID de l&#39;échantillon. Charge 2 uL d&#39;échantillon sur la partie inférieure piédestal et cliquez sur Mesure. Une partie aliquote fraîche 2 uL d&#39;échantillon doit être utilisé pour chaque mesure. </li><li> Essuyez l&#39;échantillon à partir du socle inférieure et supérieure à l&#39;aide d&#39;un laboratoire chiffon sec. </li></ol> e. Mesures microvolume dosage BCA nettoyage et le reconditionnement Effectuer le nettoyage et le reconditionnement comme décrit dans l&#39;A280 directs mesures d&#39;absorbance. Les résultats représentatifs: La détermination microvolume concentration en protéines est effectué soit par un effet direct A280 mesure ou un dosage indirect colorimétrique. L&#39;exemple le A280 mesure détermine la concentration de protéines basé sur le coefficient d&#39;extinction de la protéine d&#39;intérêt. L&#39;exemple le BCA dosage colorimétrique détermine la concentration de protéines basée sur une courbe standard de concentrations de protéines connues.

<ol>
	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

Les auteurs sont des employés de Thermo Fisher Scientific, qui produit des réactifs et des outils utilisés dans cet article.

Quantification microvolume utilise les propriétés intrinsèques de tension de surface d&#39;un échantillon pour former une colonne de liquide entre deux surfaces de mesure. L&#39;absence d&#39;un dispositif de confinement, permet la longueur du chemin à changer en temps réel, éliminant la nécessité d&#39;effectuer des dilutions. Cette capacité augmente considérablement la plage dynamique des concentrations de protéines ainsi que la vitesse de mesure. En utilisant des quantités minimes de l&#39;échantillon, un grand nombre d&#39;échantillons peuvent être analysés rapidement et avec précision, permettant aux scientifiques de prendre plus de mesures et d&#39;atteindre un meilleur contrôle de la qualité. En outre, et si nécessaire, de précieux échantillons peuvent être récupérés après la prise d&#39;une mesure. Lorsque ces petits volumes sont mesurés, l&#39;homogénéité de l&#39;échantillon est extrêmement important d&#39;éviter les erreurs d&#39;échantillonnage. Faible embouts de pipette de rétention doit toujours être utilisé pour les échantillons de chargement et les conseils devraient être changés entre l&#39;échantillon répétitions. Les surfaces piédestal doit être correctement nettoyée et conditionnée afin d&#39;assurer des résultats plus précis. Enfin, le spectrophotomètre microvolume est idéal lorsque l&#39;échantillon est limité, cependant, la facilité d&#39;utilisation, la vitesse et une gamme dynamique étendue du spectromètre rendent approprié lorsque l&#39;échantillon est abondante.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory wipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>23250</td>
<td>Reducing agent compatible</td>
</tr>
<tr>
<td>PR-1 Reconditioning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

Spectrophotométrie classique exige de placer les échantillons dans des cuvettes ou des capillaires. Cela est souvent impraticable en raison des volumes d&#39;échantillon limitée souvent utilisé pour l&#39;analyse des protéines. Le Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotomètre résout ce problème avec un système de rétention d&#39;échantillon innovantes qui détient des échantillons microvolume entre deux surfaces de mesure en utilisant les propriétés de tension superficielle des liquides, permettant la quantification des échantillons dans des volumes aussi faibles que 0,5 à 2 uL. L&#39;élimination des cuvettes ou des capillaires permet de modifier en temps réel dans la longueur du trajet, ce qui réduit le temps de mesure tout en augmentant considérablement la plage dynamique des concentrations de protéines qui peuvent être mesurés. Le besoin de dilutions est également éliminé, et les préparatifs pour la quantification de l&#39;échantillon sont relativement faciles que les surfaces de mesure peut être simplement essuyé avec le laboratoire essuyer. Cet article présente la vidéo de modifications aux méthodes traditionnelles de protéines de concentration de détermination pour la quantification des quantités de protéines en utilisant microvolume A280 lectures d&#39;absorbance ou le dosage colorimétrique BCA.

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Échantillons microvolume sont quantifiés par un système qui utilise un spectrophotomètre tension de surface naturelle à conserver des échantillons sans l&#39;utilisation des cuvettes ou des capillaires. La gamme dynamique des concentrations de protéines et de la vitesse à laquelle ils peuvent être mesurés sont fortement augmentées avec cette méthode.

Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000c

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

<a class="grey_button" href="/video/1770">&#x4E2D;&#x6587;</a><a class="grey_button" href="/video/1920">Deutsch</a> <a class="grey_button" href="/video/1921">Fran&#231;ais</a> <a class="grey_button" href="/video/1922"> Espa&ntilde;ol </a> <a class="grey_button" href="/video/2187"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

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Research

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Biology

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Vidéo: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

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The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

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Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

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Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantification des ADNdb utilisant le Hitachi F-7000 Spectrophotomètre de fluorescence et de PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Détermination de la concentration des acides nucléiques et des protéines en utilisant le micro-volume Bio-spec Spectrophotomètre Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Détermination des interactions protéine-ligand à l&#39;aide différentielle à balayage Fluorimétrie

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000c

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