I.光度計2000C分光光度計の技術は、キュベットやキャピラリーを使用せずに2つの光学面の間微量のサンプルを保持して測定する表面張力を使用している革新的なサンプル保持システムに基づいています。光度計2000C分光光度計は、迅速かつ容易にタンパク質、DNA、RNA、および他の生体分子0.5〜2μLの液滴を測定するためにこの技術を使用しています。分子生物学的手法が継続的に分析するための材料の少量を使用するために進化しているため、この機能はますます重要になっています。サンプルが限られている条件のための微量分光光度計の理想。サンプルの十分な量が利用可能な場合、しかし、使い易さ、高速の測定サイクルとし、広範な濃度範囲はまた、分光光度計が適しています。測定サイクルも大幅に科学者がワークフロー全体の効率を高める支援、低減されます。 マイクロサンプルは、検出面の上に直接配置され、液柱は、表面張力により光ファイバの両端の間に作成されます。この液柱は垂直方向の光路を形成している。キセノン​​フラッシュランプは、光源を提供し、リニアCCDアレイを利用した分光計は、試料を通過する光を分析するために使用されます。 このようなシステムからキュベットなどの伝統的な封じ込めのデバイスを削除すると、いくつかの利点があります：サンプルの非常に少量の測定に必要とされる、クリーンアップは、単にラボペーパーで光学面を拭くことが必要であり、パスの長さは、測定中にリアルタイムで変更することができます。 光度計2000Cは、希釈することなく可能なタンパク質濃度の測定値の最も広範な範囲を提供し、（0.05 mmまで1mm）を自動的に最適なパスの長さを決定します。パスの長さを短くすることで、タンパク質のより高い濃度を測定することができます。これは事実上ほとんどのタンパク質サンプルの希釈を実行する必要がなくなります。例えば、光度計2000Cは400 mg / mLのと同じくらい高いBSAの濃度を測定することができます。 光度計2000C分光光度計ではDNA、RNA、タンパク質、および他の生体分子の吸光度を測定するための完全なスペクトルを分光光度計です。このビデオプロトコルは、タンパク質の測定に焦点を当てます。 II。 A280吸光度測定を用いた微量タンパク質の濃度測定 A. A280測定の原理タンパク質A280法は、280 nmにおけるトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン残基またはシステイン - システインジスルフィド結合と展示吸光度を含む精製タンパク質に適用可能である。このメソッドは、精製タンパク質の濃度を計算するための吸光係数またはモル吸光係数のどちらかと組み合わせてA280の吸光度値を使用しています。直接A280測定の利点は、標準曲線の生成はタンパク質濃度を決定するために必要とされていないことです。サンプルは、そのようなBCA、ピアース660nmの、ブラッドフォード、およびローリーアッセイとして光度計2000/2000cで利用可能な事前構成さ比色法、のいずれかを使用して、未知のタンパク質溶液、細胞溶解液、または粗タンパク質抽出物である場合は、お勧め。 B.微量タンパク質A280測定 - スタートアップ<ol><li>メインメニューからタンパク質A280アプリケーションを選択します。 </li><li>ドロップダウンリストから、測定する試料の種類を選択します。デフォルト設定は1 ABS = 1 mg / mLと最も未知のタンパク質の混合物をお勧めします。以前に特徴付け精製したタンパク質を測定する場合は、吸光係数またはモル吸光係数と分子量のどちらがより正確にタンパク質濃度を決定するために入力することができます。 </li><li>ドロップダウンリストから濃度の単位を選択してください。 </li></ol> C.微量タンパク質A280測定 - ブランキング<ol><li>適切なバッファを使用して空白を確立する。タンパク質を停止しているバッファを使用することが重要です。使用されるバッファは、同じpHと試料溶液と同様のイオン強度のはずです。注：RIPAバッファーは、280 nmであまりにも多くの吸光度を貢献するため、直接A280のタンパク質の測定値と互換性がありません。 RIPA緩衝液に懸濁してタンパク質においては、タンパク質濃度がRIPAバッファー互換性のある比色アッセイを用いて決定することをお勧めします。 </li><li>ピペット下部の台座の上に適切なブランク溶液2μL、アームを下げ、空白]をクリック。 </li><li>乾いたラボ用ワイプを使用して下限と上限の測定面からブランク溶液を拭き取ります。 </li></ol> D.測定微量タンパク質A280測定重要な考慮事項：サンプルの均質性は極めてですこのような小さな音量から重要が測定されている。静かに、試料が均質であることを確認し、徹底的に測定するための一定分量を服用する前に、直ちに試料を混合する。ミキシングとピペッティング時に気泡を導入することは避けてください。 異なるタンパク質間の表面張力の変動に起因する、我々は、適切な列の形成を確保するためにサンプルを2μLをロードすることをお勧めします。低リテンションピペットチップを必ず使用してください。ピペットチップの外側に付着するソリューションを防ぐために、ソリューションを追放しながらサンプルをロードするには、低い光学台座の表面にピペットの先端に触れる。パンクと試料中の気泡の侵入を防ぐため、サンプルの完全な量よりも少ない者を追放。 <ol><li>適切なフィールドでのサンプルIDを入力し、ブランクとクリックして測定のために説明したように、最初のサンプルの負荷2μL。サンプルの新鮮な2μlのアリコートを各測定に使用する必要があります。 </li><li>乾いたラボ用ワイプを使用して下限と上限の台座からサンプルを削除します。 </li></ol> E.クリーニング微量タンパク質A280測定通常、リントフリー、ラボペーパーでは、多くの場合、測定値間の光台座を掃除するのに十分です。 F.再調整タンパク質A280測定の操作界面活性剤を含む溶液や試薬は、フォームにサンプル液のカラムを防止する、時間をかけて測定部の表面を無条件性があります。下の台座の上に液滴の平坦化は、光学面は、無条件になることを示している。表面特性が危険にさらされている場合、台座を再調整すると、サンプルの列の形成を確保することが重要です。この問題が発生した場合、バフ精力的に実験室を使用して光学面は、指示通り光度計台座コンディショニング化合物（PR - 1）を拭いたり、使用してください。 III。比色定量法を用いた微量タンパク質の濃度測定 A.比色検出の原理光度計2000Cの分光光度計は、比色アッセイを用いて未知タンパク質溶液、細胞ライセート、および粗タンパク質抽出物を測定するために使用することができます。 比色法は、可視波長範囲の光を吸収する新しい複合体をサンプルのタンパク質成分と色素の相互作用を伴う間接的な方法です。 光度計2000C分光光度計は、BCA、ピアース660、ブラッドフォード、およびローリーの方法を含むいくつかの事前設定済みの比色定量法を持っています。 BCAアッセイは、微量分光光度計を使用して例比色アッセイとして実証される。 （スクリーンショット） BCA（ビシンコニン酸）アッセイは、しばしば重要なUV（280 nm）の吸光度を有する成分の存在下で希釈タンパク質溶液と蛋白質のために使用される一般的な比色法です。タンパク質A280法とは異なり、タンパク質BCA法は、サンプルのタンパク質濃度を測定する前に、検量線の作成が必要となります。 方法は、検出試薬としてビシンコニン酸（BCA）を使用します。タンパク質の存在下で形成された銅- BCAキレートは、562 nmで測定し、750 nmでノーマライズされます。 B.微量BCAアッセイ測定BCAアッセイの準備<ol><li> BCA試薬、BCA試薬B、互換性の試薬、再構成バッファ、およびアルブミン（BSA）の規格：必要な試薬は還元剤と互換性キット（。。サーモサイエンティフィックピアスカタログ番号23250）に含まれています。 </li><li>室温にすべての未知の蛋白質と蛋白質の基準を平衡化し、よく混ぜる。 </li><li>試薬の50:1比率を使用して測定する基準とサンプルのために十分な新鮮な作業試薬を準備します。B </li><li>マイクロアッセイのために、サンプルに試薬を作業の1:1の比率を使用してください。すべてのサンプルおよび標準をカバーするのに十分な管で各試験管に試薬を、作業の10μLを追加。高域のアッセイのために、サンプルに試薬を作業の20:1の比率を使用してください。すべてのサンプルおよび標準をカバーするのに十分な管で各試験管に試薬を働くの190μLを加える。あなたのサンプルに適している比率を決定するピアースBCAキット文献を参照してください。 </li><li>試薬を含む各チューブに標準またはサンプル10μLを加える。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。 </li><li> 37チューブをインキュベート℃で30分間。 </li><li>反応は室温（〜10分）に平衡させる。 </li></ol> C.検量線を作成する微量BCAアッセイの測定<ol><li>メインメニューからのタンパク質BCA法を選択してください。波長の確認ウィンドウが表示された場合は、腕がダウンしていることを確認してください。 </li><li>右ペインのテーブル内の各標準濃度の値を入力します。ソフトウェアは、基準と最大7 additすることができますional規格。リファレンスおよび/または基準を複製するに測定する必要があります。 注：標準曲線を生成するための最小要件は、2つの規格の測定やゼロ基準と少なくとも1つの標準の測定値です。それは、追加の基準が期待されるアッセイの濃度範囲をカバーするために、必要に応じて含まれることをお勧めします。 </li><li>空白を確立する。比色アッセイのための空白は、一般的にH 2 Oを脱イオン</li><li>ピペット下部の台座の上にのdH 2 O 2μL、アームを下げ、空白]をクリック。唯一の空白は、基準や規格のすべての測定をカバーする必要があります。 </li><li>下の台座の上にタンパク質を持つ唯一の作業試薬およびバッファーを含む2μLアリコートをピペッティングすることにより基準を確立する。腕とクリックの測定を下げます。 </li><li>標準のタブの下に、下の台座上に所望の標準の必要な標準とピペット2μLを強調表示します。腕とクリックの測定を下げます。すべての規格のためのプロセスを繰り返します。測定サンプルの前にすべての基準を測定してください。標準曲線を表示するには、標準曲線の表示]をクリックします。 </li></ol> D.微量BCAアッセイ測定の実行2μLタンパク質測定<ol><li>規格のすべてが測定された後、サンプルのボタンをクリックしてください。サンプルIDを入力してください。下の台座の上に試料2μLをロードし、メジャー]をクリックします。サンプルの新鮮な2μLアリコートを各測定に使用する必要があります。 </li><li>乾いたラボ用ワイプを使用して下限と上限の台座からサンプルを拭き取ります。 </li></ol> E.微量BCAアッセイ測定クリーニングと再調整クリーニングと直接A280吸光度測定で説明されているように再調整を行います。 代表的な結果： 微量タンパク質の濃度測定は、直接A280測定または間接的な比色アッセイのいずれかで実行されます。 A280測定例では、目的のタンパク質の吸光係数に基づいてタンパク質濃度を決定する。 BCA比色アッセイの例は、既知のタンパク質濃度の標準曲線ベースのタンパク質濃度を決定する。

<ol>
	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

著者は、この記事で使用される試薬やツールを生成するサーモフィッシャーサイエンティフィックの従業員です。

微量定量には2つの測定面の間に液柱を形成するために、試料の固有の表面張力のプロパティを使用しています。封じ込め装置がない場合は、パスの長さが本質的に希釈を行うために必要がなくなり、リアルタイムで変更することができます。この機能により、タンパク質濃度のダイナミックレンジだけでなく、測定の速度が向上します。サンプルの最小限の量を使用することにより、多数のサンプルは、科学者はより多くの測定を行い、より良い品質管理を達成できるよう、迅速かつ正確に分析することができます。さらに、必要に応じて、貴重なサンプルが測定を受けた後、回復することができます。このような小さなボリュームが測定されているときに、サンプルの均一性は、サンプリングエラーを回避することが非常に重要です。ローリテンションピペットチップは、常にロードするサンプルを使用する必要がありますとヒントはサンプル複製の間で変更する必要があります。台座の表面は適切に洗浄し、最も正確な結果を確保するために条件付けされている必要があります。最後に、サンプルが限られているときに微量分光光度計が理想です、しかし、使い易さ、速度、および分光器の広ダイナミックレンジは、サンプルが十分にあるときに適しています。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory wipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>23250</td>
<td>Reducing agent compatible</td>
</tr>
<tr>
<td>PR-1 Reconditioning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

従来の分光光度計は、キュベットやキャピラリーにサンプルを配置する必要があります。これが原因で、しばしばタンパク質の解析に使用される限られたサンプル量にしばしば非現実的です。サーモ科学光度計2000C分光光度計では0.5〜2μLの低ボリュームで試料の定量を可能にする、液体の表面張力のプロパティを使用して2つの測定面の間に微量の試料を保持している革新的なサンプル保持システムでこの問題を解決します。キュベットやキャピラリーの除去は、大幅に測定可能なタンパク質濃度のダイナミックレンジを増加させながら測定時間を短縮経路長のリアルタイムの変化を、可能です。希釈の必要性も排除し、測定面が単にラボ用ワイプで拭くことができるようにサンプルの定量化のための準備が比較的容易であるされています。このビデオの記事では、A280吸光度またはBCA比色アッセイを用いてタンパク質の微量な量の定量化のための伝統的なタンパク質濃度の決定方法に変更を提示。

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

微量のサンプルをキュベットまたは毛細血管を使用せずに試料を保持する天然の表面張力を使用する分光光度計システムにより定量化されています。それらを測定できるようにするためのタンパク質濃度と速度のダイナミックレンジが大幅にこの方法で増加している。

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

<a class="grey_button" href="/video/1770">&#x4E2D;&#x6587;</a><a class="grey_button" href="/video/1920">Deutsch</a> <a class="grey_button" href="/video/1921">Fran&#231;ais</a> <a class="grey_button" href="/video/1922"> Espa&ntilde;ol </a> <a class="grey_button" href="/video/2187"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Research

JoVE Journal

Biology

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ビデオ: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

生物学

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

でアニマルキャップの移植（ACT）アッセイを用いて組織の決定アフリカツメガエル</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

日立F - 7000蛍光分光光度計とPicoGreen色素を使用してdsDNAの定量化

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

核酸の光度計微量定量

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

マイクロボリュームバイオスペックナノ分光光度計を用いて核酸およびタンパク質の濃度測定

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

示差走査蛍光光度を用いたタンパク質 - リガンド相互作用の定量

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

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