I. NanoDrop 2000c 분광 NanoDrop 기술 cuvettes 또는 모세 혈관의 사용없이 2 광학 받침대 사이 microvolume 샘플을 보유하고 측정하는 표면 장력을 사용하는 혁신적인 샘플 유지 시스템을 기반으로합니다. NanoDrop 2000c 분광 광도계는 빠르고 쉽게 0.5-2 단백질 μL 방울, DNA, RNA 및 기타 biomolecules을 측정하기 위해이 기술을 사용합니다. 분자 기법을 지속적으로 분석 물질의 작은 금액을 사용하는 발전으로이 기능은 점점 더 중요 해지고있다. 샘플이 제한되는 조건에 대한 microvolume 분광 광도계의 이상적. 시료의 충분한 양을 사용할 때 그러나 쉬운의 사용, 빠른 측정주기와, 그리고 다양한 농도 범위는 또한 분광 광도계가 적합합니다. 측정주기는 크게 과학자들이 자신의 워크플로우 전반에 걸쳐 효율성을 높이는 데 도움이 줄어 듭니다. microsample는 감지 표면 위에 직접 위치하고 있으며 액체 열은 표면 장력에 의해 광섬유의 끝부분 사이에 생성됩니다. 이 액체 열은 수직 광 경로를 형성한다. 크세논 플래시 램프는 광원과 선형 CCD 배열이 시료를 통과 빛을 분석하는 데 사용됩니다 활용 분광계를 제공합니다. 시스템에서 같은 cuvettes 전통 억제 장치를 제거하면 몇 가지 장점이 있습니다 : 샘플의 매우 작은 양의 측정을 위해 필요한, ​​청소는 단순히 무기를 닦아와 광학 표면을 닦아 내고 필요로하고, 경로 길이가 측정하는 동안 실시간으로 변경할 수 있습니다. NanoDrop 2000c는 dilutions없이 가능한 단백질 농도 측정의 가장 광범위한 범위를 제공 (1 mm까지 0.05 ㎜) 자동으로 최적의 경로 길이를 결정합니다. 경로 길이를 단축함으로써, 단백질의 높은 농도는 측정할 수 있습니다. 이것은 효과적으로 대부분의 단백질 샘플 dilutions을 수행하기 위해 필요를 제거합니다. 예를 들어, NanoDrop 2000c 400 MG / ML만큼 높은 BSA의 농도를 측정할 수 있습니다. NanoDrop 2000c 분광은 DNA, RNA, 단백질 및 기타 biomolecules의 흡광도를 측정하는 전체 스펙트럼 분광 광도계이다. 이 비디오 프로토콜은 단백질의 측정에 초점을 맞출 것이다. II. A280 흡광도 측정을 사용하여 Microvolume 단백질 농도 결정 A. A280 측정 원리 단백질 A280 방법은 280 nm의에서 트립토판, 티로신, 페닐알라닌 잔류물 또는 시스테인 - 시스테인 disulphide 채권 및 전시 흡광도를 포함하는 단백질을 정화하기 위해 적용됩니다. 이 방법은 정화 단백질의 농도를 계산하기 위해 대량 멸종 계수 또는 어금니 흡광 계수 중 하나와 함께 A280 흡광도 값을 사용합니다. 직접 A280 측정의 장점은 표준 곡선의 생성이 단백질 농도를 결정하기 위해 필요하지 않습니다 것입니다. 샘플 uncharacterized 단백질 솔루션, 휴대 lysate, 또는 조잡한 단백질 추출물 경우, 다음과 같은 BCA, 피어스 660 NM, 브래드 포드, 그리고 로리 assays로 NanoDrop 2000/2000c에서 사용할 수있는 미리 구성된 colorimetric 방법 중 하나입니다 사용 좋습니다. B. Microvolume 단백질 A280 측정 - 시작 <ol><li> 주 메뉴에서 단백질 A280 응용 프로그램을 선택합니다. </li><li> 드롭 다운 목록에서 측정 샘플의 유형을 선택합니다. 기본 설정은 대부분의 알려지지 않은 단백질 혼합물있는 1 애비 = 1 MG / ML. 권장합니다 이전 특징 정화 단백질을 측정하는 경우에는 대량 멸종 계수 또는 어금니 흡광 계수와 분자량도 더 정확하게 단백질 농도를 결정하기 위해 입력할 수 있습니다. </li><li> 드롭 다운 목록에서 농도 단위를 선택합니다. </li></ol> C. Microvolume 단백질 A280 측정 - 블랭킹 <ol><li> 적절한 버퍼를 사용하여 빈을 설정합니다. 단백질이 정지되는 버퍼를 사용하는 것이 중요합니다. 사용되는 버퍼 같은 산도 및 샘플 솔루션으로 비슷한 이온 강도의해야합니다. 참고 : 리파 버퍼는 280 nm의 흡광도에서 너무 많이 기여하고 따라서 직접 A280 단백질 측정과 호환되지 않습니다. 리파 버퍼에 일시 중지 단백질의 경우, 그것은 단백질 농도가 리파 버퍼 호환 colorimetric 분석을 사용하여 결정하는 것이 좋습니다. </li><li> 하단 받침대에 해당 블랭킹 솔루션의 피펫 2 μL은 팔을 절감하고 빈을 클릭합니다. </li><li> 마른 실험실이 닦아 사용하여 낮은과 상부 받침대에서 빈 솔루션을 닦아주십시오. </li></ol> D. 측정 Microvolume 단백질 A280 측정 중요 고려 사항 : 샘플의 균질성은 매우있다이러한 작은 볼륨부터 중요한이 측정되고있다. 부드럽게, 샘플 동질적인 것을 보장하지만 철저하게 측정 나누어지는을 복용하기 전에 즉시 샘플을 혼합합니다. 혼합 및 pipetting 할 때 거품을 도입하지 마십시오. 다른 단백질 사이의 표면 장력의 변화로 인해, 우리는 적절한 열 형성을 위해 샘플을 2 μL를 로드할 것을 권장합니다. 낮은 유지 피펫 팁을 항상 사용합니다. 피펫 팁의 외부로 준수의 솔루션을 방지하기 위해 솔루션을 추방하면서 샘플을로드하려면, 아래 광학 받침대 표면에 피펫 팁을 터치. 폭발 및 샘플의 거품의 도입을 방지하기 위해 샘플의 전체 금액보다 적은 금액을 추방. <ol><li> 해당 필드에 샘플 ID를 입력 빈을 클릭 법안에 대한 설명으로 첫 번째 예제 2 μL를로드합니다. 시료의 신선한 2μL 나누어지는 각 측정에 사용해야합니다. </li><li> 마른 실험실이 닦아 사용하여 낮은과 상부 받침대에서 샘플을 제거합니다. </li></ol> E. 청소 Microvolume 단백질 A280 측정 일반 보푸라기가없는, 실험실 닦아 자주 측정 사이의 광학 받침대 청소 충분합니다. F. Reconditioning 단백질 A280 측정 만들기 계면 활성제를 포함하는 솔루션 및 시약은 양식 샘플 액체 열 방지, 시간이 지남에 따라 측정 페데 스탈 표면을 uncondition 수 있습니다. 하단 받침대에있는 비말의 평평화은 광학 표면이 무조건 될 나타내는 것입니다. 표면 특성에 문제가있다면, 받침대를 reconditioning하면 샘플 열 형성을 보장하는 것이 중요합니다. 이 문제가 발생하면 털많은 적극적으로 실험실 닦아 또는 지시대로 (PR - 1) NanoDrop 받침대 Reconditioning 컴파 운드를 사용을 사용하여 광학 표면. III. Colorimetric Assays를 사용 Microvolume 단백질 농도 결정 A. colorimetric 검출의 원리 NanoDrop 2000c 분광 광도계는 colorimetric assays를 사용하여 uncharacterized 단백질 솔루션, 세포 lysates, 그리고 원유 단백질 추출물을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. Colorimetric 방법은 보이는 파장 범위의 빛을 흡수하는 새로운 복합을 생산하기 위해 샘플의 단백질 구성 요소와 염료의 상호 작용을 포함 간접 방법입니다. NanoDrop 2000c 분광 광도계는 BCA, 피어스 660, 브래드 포드, 그리고 로리 방법 등 여러 가지 사전 구성된 colorimetric assays 있습니다. BCA의 분석은 microvolume 분광 광도계를 사용하여 예제 colorimetric 분석으로 입증됩니다. (스크린샷) BCA (Bicinchoninic의 산성) 분석은 종종 중요한 UV (280 nm의) 흡광도를 구성 요소의 존재에 희석 단백질 솔루션 및 단백질에 사용되는 일반적인 colorimetric 방법입니다. 단백질 A280 방법과는 달리 단백질 BCA 방법은 샘플의 단백질 농도를 측정하기 전에 표준 곡선이 생성되어야합니다. 방법은 검출 시약으로 bicinchoninic 산성 (BCA)를 사용합니다. 단백질의 존재에 형성 잘라내기 - BCA 킬레이트는 562 nm의에서 측정하여 750 nm의에 정상화됩니다. B. Microvolume BCA 분석 측정 BCA 분석 준비 <ol><li> BCA 시약, BCA 시약의 B, 호환성 시약, Reconstitution 버퍼, 그리고 알부민 (BSA) 기준 : 필요한 시약은 감소 에이전트 호환 키트 (.. 써모 과학 피어스 고양이도 23250)에 포함되어 있습니다. </li><li> 상온의 모든 미지의 단백질과 단백질 수준을 평형 철저히 섞는다. </li><li> 시약의 5​​0:1 비율을 사용하여 표준과 측정에 샘플을 충분히 신선한 작업 시약 준비 : B </li><li> 마이크로 분석을 위해, 샘플 위해 노력 시약의 1:1 비율을 사용합니다. 모든 샘플과 표준을 감추기에 충분 할만큼 튜브를 각 튜브에 시약을 조사하고 10 μL를 추가합니다. 높은 범위 분석의 경우, 샘플 위해 노력 시약의 20시 1분 비율을 사용합니다. 모든 샘플과 표준을 감추기에 충분 할만큼 튜브를 각 튜브에 시약을 조사하고 190 μL를 추가합니다. 귀하의 샘플에 적합하는 비율 결정하는 피어스 BCA 키트 문학을 참조하십시오. </li><li> 시약을 포함하는 각각의 튜브에 표준 또는 샘플 10 μL를 추가합니다. 부드럽게 vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 37 튜브를 품어 ° C를 30 분. </li><li> 반응이 실온 (~ 10 분) 평형 수 있습니다. </li></ol> C. 표준 곡선을 생성 Microvolume BCA 분석 측정 <ol><li> 주 메뉴에서 단백질 BCA 방법을 선택합니다. 파장 확인 창이 나타나면, 팔을 아래로 있는지 확인하십시오. </li><li> 오른쪽 창에서 테이블에있는 각 표준 농도에 대한 값을 입력합니다. 이 소프트웨어는 참조 최대 7 addit을 허용ional 기준. 참조 및 / 또는 표준 복제로 측정해야합니다. 참고 : 표준 곡선 생성을위한 최소 요구 사항이 두 표준의 측정 또는 제로 참조와 하나 이상의 표준의 측정이다. 그것은 추가적인 기준은 예상 분석 농도 범위를 커버하기 위해 필요한 포함하는 것이 좋습니다. </li><li> 빈을 설정합니다. colorimetric assays에 대한 공백은 일반적으로 H 2 O.을 deionized입니다 </li><li> 하단 받침대에 DH 2 O의 피펫 2 μL은 팔을 절감하고 빈을 클릭합니다. 단 한 빈은 참조 및 표준의 모든 후속 측정을 충당하기 위해 필요합니다. </li><li> 하단 받침대에 단백질에만 작업 시약 및 버퍼를 포함하는 2 μL 나누어지는을 pipetting하여 참조를 설정합니다. 팔과 클릭 법안을 낮추십시오. </li><li> 표준 탭에서 하단 받침대에 원하는 표준의 원하는 표준 및 피펫 2 μL를 강조 표시합니다. 팔과 클릭 법안을 낮추십시오. 모든 표준에 대한 과정을 반복합니다. 측정 샘플을하기 전에 모든 기준을 측정해야합니다. 표준 곡선을 보려면하면 표준 곡선보기를 누릅니다. </li></ol> D. Microvolume BCA 분석 측정 2 μL 단백질 측정 할 <ol><li> 표준의 모든 측정되었습니다 후 샘플 버튼을 클릭합니다. 샘플 ID를 입력하십시오. 하단 받침대에 시료 2 μL를로드하고 법안을 클릭합니다. 시료의 신선한 2 μL 나누어지는 각 측정에 사용해야합니다. </li><li> 마른 실험실이 닦아 사용하여 낮은과 상부 받침대에서 샘플을 닦아주십시오. </li></ol> E. Microvolume BCA 분석 측정 청소 및 Reconditioning 청소와 직접 A280 흡광도 측정에서 설명한대로 reconditioning을 수행합니다. 대표 결과 : Microvolume 단백질 농도 결정은 직접 A280 측정 또는 간접적 colorimetric 분석에 의해 수행됩니다. A280 측정 예제는 관심의 단백질의 흡광 계수에 따라 단백질 농도를 결정합니다. BCA colorimetric 분석 예제는 알려진 단백질 농도의 표준 곡선을 기반으로 단백질 농도를 결정합니다.

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	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

저자는이 문서에서 사용하는 시약 및 도구를 만들어 써모 피셔 사이 언티픽의 직원입니다.

Microvolume의 quantitation 두 측정 표면 사이에 액체 열을 형성하는 샘플의 내장 표면 장력 속성을 사용합니다. 억제 장치의 부재는 경로 길이는 본질적으로 dilutions을 수행하기 위해 않아도, 실시간으로 변경할 수 있습니다. 이 기능은 대폭 단백질 농도의 동적 범위뿐만 아니라 측정의 속도를 증가시킵니다. 시료의 최소 금액을 사용하여 샘​​플의 큰 숫자는 과학자들이 더 많은 측정을하고 더 나은 품질 관리를 달성할 수 있도록 신속하고 정확하게 분석할 수 있습니다. 또한, 필요한 경우, 소중한 샘플은 측정을 복용 후 복구할 수 있습니다. 이러한 작은 볼륨 측정되는 경우, 샘플 균질성은 샘플링 오류를 피하기 위해 매우 중요합니다. 낮은 유지 피펫 팁 항상 로딩 샘플 사용해야하고 예제 복제 사이의 팁을 변경해야합니다. 페데 스탈 표면이 제대로 청소하고 가장 정확한 결과를 보장하기 위해 냉방해야합니다. 샘플이 제한되었을 때 마지막으로, microvolume 분광 광도계가 이상적입니다, 그러나 쉬운의 사용, 속도 및 분광계의 광범위한 다이나믹 범위는 샘플이 풍부한 경우가 적합합니다.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory wipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>23250</td>
<td>Reducing agent compatible</td>
</tr>
<tr>
<td>PR-1 Reconditioning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

전통 분광 광도법은 cuvettes이나 모세 혈관에 샘플을 배치해야합니다. 이것은 종종 인해 종종 단백질 분석에 사용되는 제한된 샘플 볼륨을 모르시는 것입니다. 써모 과학 NanoDrop 2000c 분광은 0.5-2 μL으로 낮은 볼륨의 샘플 부량를 활성화, 액체의 표면 장력 특성을 사용하여 두 측정 표면 사이 microvolume 샘플을 보유하고 혁신적인 샘플 유지 시스템과 함께이 문제를 해결합니다. cuvettes이나 모세 혈관의 제거는 크게 측정할 수 단백질 농도의 동적 범위를 증가하는 동안 측정 시간을 단축 경로의 길이는 실시간으로 변경을하실 수 있습니다. dilutions에 대한 필요도 제거하고, 측정 표면은 단순히 무기를 닦아와 함께 닦아 수 있듯이 샘플 부량 준비는 비교적 간단합니다. 이 동영상이 문서에서는 A280 흡광도 수치 또는 BCA colorimetric 분석을 사용하여 단백질의 microvolume 금액의 부량 전통 단백질 농도 결정 방법 수정 사항을 제공합니다.

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolume 샘플 cuvettes이나 모세 혈관의 사용없이 샘플을 유지하기 위해 천연 표면 장력을 사용하는 분광 광도계 시스템 계량입니다. 그들이 측정 수있는 단백질 농도와 속도의 동적 범위는 크게이 방법으로 증가하고 있습니다.

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

<a class="grey_button" href="/video/1770">&#x4E2D;&#x6587;</a><a class="grey_button" href="/video/1920">Deutsch</a> <a class="grey_button" href="/video/1921">Fran&#231;ais</a> <a class="grey_button" href="/video/1922"> Espa&ntilde;ol </a> <a class="grey_button" href="/video/2187"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

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Research

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Biology

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비디오: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

연구

생물학

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

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Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

에있는 동물 캡 이식 (ACT) 어세를 사용하여 조직 결정 Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

히타치 F - 7000 형광 분광 및 PicoGreen 염료를 사용하여 dsDNA의 부량

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

마이크로 볼륨 바이오 사양 나노 분광 광도계를 사용하여 핵산 및 단백질 농도 결정

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

시차 주사 Fluorimetry를 사용하여 단백질 - 리간드 상호 작용의 결정

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

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