Los autores desean agradecer a Danielle y Demêmes Cotanche Douglas y por sus esfuerzos en enseñarnos los métodos para el aislamiento del órgano de Corti. Además, nos gustaría dar las gracias a Ismael Stefanov-Wagner para la ingeniería de los electrodos electroporador; Sherry Lin por su obra que contribuyen a la animación de vídeo, y Mateo Chana, Jason Meeker, y Kendra Marshall ( <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) para producir el vídeo. Este trabajo fue financiado por subvenciones (R03DC010065-Parker, RO1DC007174-Edge; P30DC05209-MEEI apoyo básico para la Investigación de la Audición) de la NIDCD.

Día 1. La esterilización y el recubrimiento de cubreobjetos de vidrio. <ol><li> Seco esterilizar cubreobjetos de vidrio microscopio en un autoclave. </li><li> Coloque el cubreobjetos esterilizados en dos pocillos de una pre-esterilizados cuatro y placa de cultivo celular. </li><li> Cubra el cubreobjetos con 1:1 de poli-L-ornitina y laminina complementado con suero fetal bovino 20% (FBS) durante la noche a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> 400 l de poli-L-ornitina (solución de 0,01% se almacenan a 4 ° C) </li><li> 400 laminina l (50 mg / ml de solución de archivo almacenado en alícuotas a -20 ° C) </li><li> FBS 200 l (almacenado en alícuotas a -20 ° C) </li></ol></li><li> Calor a esterilizar los instrumentos de disección durante la noche en una incubadora de 150 ° C. </li><li> Hacer un medio de cultivo que contienen 10% de suero y 10 ampicilina mg / ml. <ol class="lalpha"><li> 90 ml de Dulbecco Modificado Medio Eagle </li><li> 5 ml de FBS (almacenado en alícuotas a -20 ° C) </li><li> 5 ml de suero de caballo (almacenado en alícuotas a -20 ° C) </li><li> 10 l ampicilina (10 mg / ml de solución de archivo se almacenan a 4 ° C) </li></ol></li></ol> Día 2. Aislamiento del órgano de Corti. <ol><li> Esterilizar la campana de flujo positivo de disección. <ol class="lalpha"><li> encender la luz UV durante 20 minutos </li><li> pulverizar todas las superficies con un 70% de etanol y espere 5 minutos antes de su uso. </li></ol></li><li> Decapitar a las crías de ratón (P4) en la base del agujero occipital con unas tijeras de operación. </li><li> Brevemente enjuague la cabeza en un plato de 10 cm que contiene 70% de etanol. </li><li> Eliminar la epidermis con un bisturí. </li><li> Abrir el cráneo a lo largo de la sutura sagital con un bisturí y luego dividir en dos el cerebro anterior. Mantener el cerebro anterior caudal de disección. </li><li> Quitar el cerebro anterior, cerebelo y tronco cerebral utilizando disección roma. </li><li> Quitar los huesos temporales (Fig. 2A), sumergirlos brevemente en etanol al 70%, y transferirlos a un plato de 3 mm que contiene HBSS estéril. </li><li> Con unas pinzas, retire la bulla y el tejido circundante de la porción petrosa del hueso temporal. </li><li> Localice la concha en forma de caracol (Fig. 2B) y separarla del sistema vestibular el uso de fórceps. </li><li> En esta etapa de desarrollo, el laberinto óseo no está completamente calcificado y es fácilmente disecados con las pinzas. Retire el laberinto óseo de la cóclea por la separación cuidadosa de partida en el extremo basal y apical en movimiento con unas pinzas. </li><li> El ligamento espiral y el órgano de Corti se adjunta en espiral a lo largo de la espiral del modiolo (Fig. 2C). Retire con cuidado el órgano de Corti, asegurando el ligamento espiral en la región del gancho de la base con las pinzas y relajarse como usted se mueve hacia apical. </li><li> A partir de la base, retire el ligamento espiral del órgano de Corti con # 55 pinzas finas (Fig. 2D). Micro-aislamiento del órgano de Corti del epitelio sensorial (Opcional). </li><li> Quitar el órgano de Corti región gancho de la base con dos jeringas ½ cc con insulina permanentemente conectado U-100 28G ½ agujas como los fórceps. </li><li> Comenzando desde el ápice, eliminar el limbo espiral de la fila de las células ciliadas internas y proceder basales (Fig. 2E-F). Revestimiento del órgano de Corti explante </li><li> Eliminar la solución poly-L-ornithine/laminin/FBS de los pozos de la cultura y añadir 130 l de medio de cultivo. </li><li> Transferir el órgano de Corti diseccionado a la cubreobjetos de vidrio revestidas de la cultura y el explante y orientar de manera que los cilios de las células ciliadas están apuntando hacia arriba. </li><li> Eliminar el medio de la cultura y con una pipeta de 200 mL. Asegúrese de que la membrana basilar se pone en contacto sólido con el cubreobjetos recubiertos. </li><li> Añadir con cuidado 130 l de medio de cultivo para el órgano de Corti con una pipeta 200 ml. Aplicar dos gotas en la superficie del órgano de Corti y luego agregue lentamente el volumen restante a un lado del cubreobjetos. Asegúrese de que el órgano de Corti no flota en el medio de cultivo, pero sigue siendo colocada en el cubreobjetos. </li><li> Incubar toda la noche a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2. </li></ol> Día 3. Electroporación del gen reportero en cultivos de órganos de Corti. <ol><li> Retire el medio de cultivo del órgano de Corti cultura. </li><li> Añadir 130 l H 2 O durante 1 minuto y luego retirar con una pipeta de 200 mL. </li><li> Añadir 30 l de plásmido reportero DsRed (2 mg / mL H 2 O almacenadas a -20 ° C). </li><li> Avance de los electrodos de la electroporador utilizando un micromanipulador para que el ánodo de unacátodo º están a ambos lados de la cultura. </li><li> Generar un pulso (27V, 30 ms de duración, 10 trenes de pulsos) para electroporar el gen reportero en el órgano de Corti explante cultura. <ol class="lalpha"><li> Opcional: invertir la polaridad del pulso para asegurar la electroporación de los transgenes en los dos lados y el modiolar espiral ligamento del explante. </li></ol></li><li> Esperar 5 min. </li><li> Añadir 130 l de la Fugene 6: La solución de ADN (3 partes Fugene a 2 partes de ADN). Esta solución debe prepararse antes del inicio del procedimiento de electroporación (paso 20) con una ronda de 3 ml de fondo de poliestireno tubo de ensayo en una campana de flujo laminar. Para preparar esta solución: <ol class="lalpha"><li> Añadir 2,4 l de Opti-MEM (almacenadas a 4 ° C) al tubo de ensayo. </li><li> Añadir 0,6 l de Fugene 6 reactivo (almacenado a 4 ° C) al tubo de ensayo. Asegúrese de añadir la Fugene directamente a la Opti-MEM y evitar el contacto directo con los lados del tubo de ensayo. </li><li> Vortex durante 1 segundo. </li><li> Incubar 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 2,0 l periodista DsRed plásmido ADN de doble cadena (almacenadas a -20 ° C a 100 ug de ADN / mL H 2 O alícuotas). </li><li> Vortex durante 1 segundo. </li><li> Incubar 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 200 l de medio de cultivo. </li><li> Vortex durante 1 segundo. </li></ol></li><li> Incubar toda la noche a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Añadir 2 ml de medio de cultivo a la cultura e incube a 37 ° C durante un máximo de 10 días. </li></ol> Resultados representante Se presenta un método para el aislamiento del órgano de Corti de un ratón perinatal. El procedimiento se puede utilizar para los ratones de tan sólo el día embrionario 16 hasta aproximadamente el día postnatal 6, momento en el que el laberinto óseo se vuelve lo suficientemente calcificados para hacer la disección engorroso. Una vez que el órgano de Corti es disecado, puede ser plateado y cultivadas, ya sea en su totalidad (Fig. 3) o como micro-aislados epitelio sensorial (Fig. 4). Además, hemos presentado una técnica para expresar genes exógenos en el órgano de Corti cultivadas. El cultivo organotípico es útil para muchos otros tipos de estudio, tales como el análisis del órgano de Corti expresión génica mediante RT-PCR o hibridación in situ, el órgano de Corti co-cultivo con células del ganglio espiral o células madre exógenas con el aislamiento de micro- 3, o en análisis in vitro de la muerte celular y la regeneración del cabello. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /></a> Figura 1. Sección transversal del órgano de Corti P4 murino. (A) Una sección transversal de la vuelta basal de la cóclea cryosectioned obtenido de un ratón P4 ilustra las estructuras generales de la cóclea murino se describe en este protocolo. La escala media está bordeado por el ligamento espiral y la estría vascular lateralmente, la membrana de Reissner s superior, la espiral limbo medial, y la membrana basilar hacia abajo. La caja indica la región se expandió en B. (B) El órgano de Corti se encuentra en la parte superior de la membrana basilar, e incluye una hilera de células ciliadas internas, tres hileras de células ciliadas externas, y sus respectivas celdas de apoyo. Una línea de puntos indica la localización a lo largo de la membrana basilar que se elimina durante este órgano de la disección de Corti. La línea de puntos 2 indica la ubicación a lo largo de la membrana basilar que se elimina durante el proceso de micro-aislamiento. El color verde indica marcaje inmunohistoquímico de calbindina, que las etiquetas de las células interdentales del limbo espiral, las células cocleares del cabello, las neuronas del ganglio espiral, así como las células del ligamento espiral y vascular 7 estría. DAPI etiquetado de los núcleos en azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /></a> Figura 2. Órgano de Corti disección. Las imágenes del vídeo de acompañamiento del órgano de Corti destacar la disección A) el sistema vestibular y la cóclea situada dentro del hueso temporal aislados (rojo), B) el laberinto óseo de la cóclea, C) el ligamento espiral y unida órgano de Corti después de la eliminación del laberinto óseo, D) la eliminación del ligamento espiral y la estría vascular (rojo) del órgano de Corti, E) micro-aislamiento del epitelio sensorial del limbo espiral (color rojo), y la F) aislados limbo espiral (izquierda) y el epitelio sensorial (derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /></a> Figura 3. Órgano de Corti explante cultivados. DIC imagen que muestra el órgano deCorti de un P4 Atoh1-nGFP ratón que fue aislado, plateado, y se cultivaron durante cinco días, tal como se describe. Este ratón ha sido genéticamente modificados para que las células que expresan el gen de las células pro-pelo atonal homólogo 1 (aka Atoh1 Math1) presentan una proteína verde fluorescente que se localiza en el núcleo 8. Los órganos de Corti de estos ratones presentan una etiqueta GFP nuclear en todos los núcleos de las células del pelo y por lo tanto, permiten una fácil visualización del epitelio sensorial mediante un microscopio de epifluorescencia. La espiral relativamente grande limbo puede ser visto por fuera del epitelio sensorial. Las células mesenquimales que tienen su origen en el órgano de Corti han emigrado fuera del explante. Etiqueta azul es nuclear DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" /></a> Figura 4. Micro-aislados epitelio sensorial. Epifluorescencia la imagen obtenida del epitelio sensorial que se ha aislado de un órgano de Corti P4 murino como se describe y se cultivan durante la noche. El micro-aislamiento se fija entonces en paraformaldehído al 4% y se procesaron para inmunomarcación de 7a miosina que las etiquetas de las células cocleares del cabello. Nótese la ausencia de la espiral comparativamente mayor limbo de la figura 3. Etiqueta azul es nuclear DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" /></a> Figura 5. Electroporación del gen reportero DsRed en el órgano de Corti cultivadas. Órganos enteros de Corti de P4 Atoh1-nGFP crías de ratón fueron aisladas, plateado, y luego electroporated con el gen reportero DsRed como se describe y luego se observan bajo un microscopio de epifluorescencia. Las células del órgano de Corti explante que expresa la proteína transgénica reportero DsRed células presentan una fluorescencia roja y endógenos de la exposición del epitelio sensorial una fluorescencia verde nuclear. Células transgénicas se pueden ver en el limbo espiral y el epitelio sensorial.

<ol>
	<li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Development+of+the+Organ+of+Corti+in+Culture.">Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture.</a> Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).</li><li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears.">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).</li><li>Martinez-Monedero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+POTENTIAL+ROLE+OF+ENDOGENOUS+STEM+CELLS+IN+REGENERATION+OF+THE+INNER+EAR.">THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR.</a> J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).</li><li>Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RT-PCR+analysis+of+mRNA+for+growth+factor+receptors+in+damaged+and+control+sensory+epithelia+of+rat+utricles.">An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles.</a> Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge.">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).</li><li>Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+Differentiation+and+DNA+Binding+(Ids)+Regulate+Math1+and+Hair+Cell+Formation+during+the+Development+of+the+Organ+of+Corti.">Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti.</a> J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).</li><li>Daniela, B., Josef, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calbindin+and+S100+protein+expression+in+the+developing+inner+ear+in+mice.">Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).</li><li>Helms, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).</li><li>Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Damage+to+Auditory+Neurons+and+Hair+Cells+by+Ototoxins+and+Neuroprotection+by+Specific+Neurotrophins+in+Rat+Cochlear+Organotypic+Cultures.">Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).</li></ol>

Hay varios detalles que son fundamentales para el éxito de este procedimiento. Cuanto más corto sea el tiempo de aislamiento de los temporales de órgano de Corti de incubación, mayor será la posibilidad de que los órganos se conectará con el cubreobjetos y el resultado en cultivos de órganos viables. Por lo tanto, es importante limitar la cantidad de tiempo que transcurre entre la disección y la colocación de los órganos en la incubadora. La elección del antibiótico es también crucial, ya que muchos antibióticos aminoglucósidos son ototóxicos y puede provocar la muerte de las células ciliadas. A pesar de que es preferible renunciar al uso de antibióticos por completo, lo que deja abierta la posibilidad de contaminación. Por lo tanto, se sugiere el uso de 10 mg / ml ampicilina, como regla general para superar los problemas potenciales de contaminación. El aspecto más problemático de este y otros procedimientos para el cultivo primario del órgano de Corti, es la tendencia de los órganos de flotar fuera de los platos durante la incubación. Aunque los cultivos flotantes órgano puede permanecer viable durante 5-7 días, hay inconvenientes de los órganos de cultivo flotantes. Por ejemplo, flotando cultivos de órganos a menudo veces sobre sí mismos después de 4-5 días la prestación de microscopía problemática. Posteriormente, la integridad estructural del órgano puede verse en peligro si se compara con los órganos que se han colocado a la cubreobjetos. Hemos encontrado que las siguientes técnicas ayudan a asegurar que el órgano de Corti no flota en el medio de cultivo, pero sigue siendo colocada en el cubreobjetos. En primer lugar, la capa de vidrio en el cubreobjetos 01:01 poliornitina / laminina suplementado con FBS al 20% tal como se describe. La incubación durante la noche las establecidas en el protocolo es el tiempo mínimo que la placa debe ser cubierto. En nuestro laboratorio, a menudo abrigo de todas las planchas que se necesitan para la semana y mantenerse a 4 ° C hasta el día antes de su uso cuando los movemos a la incubadora de una incubación durante la noche. En segundo lugar, después de que los órganos se transportan a la cubreobjetos recubiertos, orientar el explante de manera que los cilios de las células de pelo hacia arriba. Esta orientación facilitará la adhesión de la membrana basilar de la placa de cultivo. En tercer lugar, eliminar los medios de comunicación en el pozo para colocar el explante al plato cubierto. Esto asegurará el contacto entre la placa de cultivo y la membrana basilar y mejorar la capacidad de los explantes de adherirse al vidrio. Esto también ayudará a mantener la integridad estructural de las filas de las células ciliadas. Por último, con cuidado por goteo 2 gotas de medio de cultivo sobre la superficie del órgano de Corti con una pipeta 200 l de capacidad y poco a poco llenar el pozo por goteo y el volumen restante (de un total 130 l) en el lado del cubreobjetos. Es importante trabajar con rapidez para asegurar la fijación del órgano de Corti a la cubreobjetos recubiertos. Desde el inicio de la disección a la incubación de los explantes, por lo general toma 10 minutos para un operador de practica para completar este órgano de Corti procedimiento de aislamiento. En este protocolo, también se presenta un método para el aislamiento de microorganismos del epitelio sensorial del limbo espiral del órgano de Corti. En este procedimiento, el limbo espiral es diseccionada en el epitelio sensorial con 28G ½ agujas de insulina como herramientas de disección. El resultado consiste en aislar los microorganismos de las filas de las células ciliadas y sus correspondientes células de apoyo (Fig. 3). El epitelio sensorial aislada se puede cultivar como se describe en este protocolo. Este procedimiento de aislamiento de micro-debe compararse con la separación enzimática de los epitelios sensoriales del tejido circundante 4. En los mamíferos, así como especies no mamíferas, tales como pollos, la digestión termolisina de que los resultados órganos vestibulares en el aislamiento de los epitelios sensoriales de las células mesenquimales sótano 4. En la rata cóclea, los resultados termolisina la digestión en la separación de la cresta superior del epitelio, menor cresta epiteliales y el epitelio sensorial que acompaña a la membrana basal 5. Sin embargo, no está claro si el epitelio sensorial coclear pueden adherirse a las placas de recubrimiento sin las células mesenquimales de acompañamiento. Mientras tanto en el micro-mecánica aislamiento método y el resultado enzimática método de digestión en la separación de los epitelios sensoriales del limbo espiral, las ventajas de la disección de micro-aislar a la digestión termolisina incluye un protocolo relativamente corto, más barato reactivos, y el estrés potencialmente menos el explante debido a los efectos de la digestión enzimática. Además, la membrana basal permanece intacta en este enfoque, que puede mejorar la conexión del epitelio sensorial de la placa de cultivo. Las desventajas de este método incluyen la necesidad de desarrollar las habilidades en la disección delicada y el daño potencial a la mecánica del epitelio sensorial como resultado de la disección micro. Como ejemplo de la utilidad de este procedimiento, también presentamos un ejemplo de la utilización de los órganos deCorti culturas, la electroporación de genes exógenos en el explante cultura. El procedimiento de electroporación descrito anteriormente se basa en los métodos anteriores de órgano de Corti electroporación. En particular, Zheng y Gao (2000) describen la electroporación de los órganos aislados de ratas de Corti, donde los explantes se mantienen en su lugar para la electroporación por un surco trazado de agarosa y chapada en colágeno recubiertas de 8 y diapositivas Labtek en medio libre de suero 2. Una de las ventajas de su enfoque es que los órganos están orientados de manera que las superficies superiores de los explantes de la cara del cátodo, que en teoría debería resultar en una distribución uniforme de las células por electroporación en todo el explante. En nuestras manos sin embargo, el método que se describe mejor en este procedimiento debido a que el órgano de Corti quedó fijada en el cubre todo el procedimiento lo que se reduce la manipulación de los explantes después de la electroporación. Además, un porcentaje más alto de los órganos de Corti se mantuvo unido a los cubreobjetos utilizando este método que se presenta. Nuestro método se ha tomado de Jones, et al. (2006) que utiliza la adición de la Fugene 6 reactivo para aumentar la eficiencia de la expresión génica después de la electroporación. En el protocolo de Jones et al. (2006), los órganos se someten a electroporación, se incubó durante 5 minutos con 100 l de reactivo de transfección Fugene 6, y se colocaron 6. Nuestro método difiere en el uso de una proporción de 3:2 de Fugene 6 reactivo al ADN plásmido, que hemos encontrado empíricamente para proporcionar la expresión transgénica óptima con toxicidad orgánica mínima. Nosotros no usamos sin diluir Fugene 6 reactivo, que puede resultar en toxicidad a los cultivos. La configuración de los electrodos en el protocolo, así como Jones et al. (2006), los resultados en la expresión génica primaria, ya sea en la espiral de limbo o epitelio sensorial dependiendo de la posición del cátodo. Aunque hay DsRed células positivas en el lado lejano de la cultura hacia el cátodo, hay una mayor concentración de células transgénicas más cerca del cátodo. Para asegurar una completa expresión del transgén en ambos lados del órgano de Corti explante, la corriente puede ser revertida por un tren de pulsos segundo, simplemente invirtiendo los cables. Los resultados presentados en el protocolo de sólida expresión de los transgenes a través del órgano de Corti (Fig. 5).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass microscope coverslips</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>DYNALAB Corporation (Rochester, NY)</td>
			<td>2010</td>
			<td>10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ringed cell culture dish</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>627170</td>
			<td>Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4957</td>
			<td>0.01% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) </td>
			<td>354232</td>
			<td>made in mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>26140-095</td>
			<td>Qualified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>RS-6806</td>
			<td>Straight, sharp-blunt length 5"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blade</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>372611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#4 Dumoxel forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11241-30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Dumostar fine forceps</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fine Science Tools (Foster City, CA)</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>10564-011</td>
			<td>High Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>2605088</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>11593-027</td>
			<td>Irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&frac12; cc Lo-Dose Insulin Syringe </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ)</td>
			<td>329465</td>
			<td>U-100 28G&frac12;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene 6 Transfection Reagent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Roche (Mannheim, Germany)</td>
			<td>11-815-091-001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene test tube</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>14-956-5A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>The Baker Company (Stanford, ME)</td>
			<td>Model SG603a</td>
			<td>SterileGARD III 
				Advanced Class II 
				Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>31985</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter plasmid</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Clontech (Mountain View, CA)</td>
			<td>632539</td>
			<td>pCMV DsRed-Express 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BioRad (Hercules, CA)</td>
			<td>165&#x2013;2662</td>
			<td>BioRad Gene Pulser Xcell</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. 

En todos los mamíferos, el epitelio sensorial de la audición se encuentra a lo largo del órgano espiral de Corti que se encuentra dentro de la cóclea en forma de caracol del oído interno (fig 1). Las células pilosas en la cóclea de desarrollo, que son las células mechanosensory del sistema auditivo, se alinean en una fila de células ciliadas internas y tres (en la base y la mitad de vueltas) a cuatro (en la vuelta apical) hileras de células ciliadas externas que abarcan todo el largo del órgano de Corti. Transducción de las células ciliadas de sonido inducida por las vibraciones mecánicas de la membrana basilar en impulsos nerviosos que el cerebro puede interpretar. La mayoría de los casos de pérdida auditiva neurosensorial son causados ​​por la muerte o la disfunción de las células pilosas cocleares. Una herramienta cada vez más esencial en la investigación auditiva es el aislamiento y cultivo in vitro de los explantes de órganos 1,2,9. Una vez aislados, los explantes se puede utilizar de varias maneras para proporcionar información sobre normativa, anómalo, o la fisiología terapéutica. La expresión génica, la motilidad estereocilios, biología celular y molecular, así como los enfoques biológicos para la regeneración de las células ciliadas son ejemplos de aplicaciones experimentales de órgano de Corti explantes. Este protocolo describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti de ratones recién nacidos. El video que acompaña incluye instrucciones paso a paso para el aislamiento del hueso temporal de crías de ratón, y el posterior aislamiento de la cóclea, el ligamento espiral, y el órgano de Corti. Una vez aislado, el epitelio sensorial puede ser plateado y se cultivan in vitro en su totalidad, o como un micro-disección más aislado que carece de la espiral de limbo y de las neuronas del ganglio espiral. Usando este método, explantes primarios se puede mantener durante 7-10 días. Como ejemplo de la utilidad de este procedimiento, el órgano de Corti explantes se electroporated con un gen reportero DsRed exógenos. Este método proporciona una mejora sobre otros métodos publicados, ya que proporciona direcciones reproducible, sin ambigüedades, y paso a paso para el aislamiento, la microdisección, y la cultura principal del órgano de Corti.

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Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

Este procedimiento describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti murino con o sin el limbo espiral y las neuronas del ganglio espiral. También demostramos un método para la expresión de un gen reportero exógenos en el órgano de Corti explante de la electroporación.

Cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

primary-culture-plasmid-electroporation-murine-organ

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

25.8K vistas.  Harvard Medical School. Este procedimiento describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti murino con o sin el limbo espiral y las neuronas del ganglio espiral. También demostramos un método para la expresión de un gen reportero exógenos en el órgano de Corti explante de la electroporación.

Video: Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Electroporación de micobacterias

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Cultivo primario de miocitos adultos de corazón de rata

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Novedoso método de plásmido ADN entrega al urotelio de la vejiga de ratón por electroporación

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Cultivo primario de células adrenocorticales rata y análisis de funciones Steroidogenic

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos orales primarios del paladar del ratón adulto

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.