Este protocolo incorpora un enfoque sencillo para agilizar los pasos de cultivo, obtener explantes de alta calidad y contribuirá a explorar y desvelar los mecanismos moleculares de las células cocleares. La principal ventaja de esta técnica es el mínimo manejo directo de los órganos mediante la coordinación de los pasos de disección, el recubrimiento adecuado de la superficie de polímero, el volumen medio optimizado y el tiempo de fijación de los explantes. Esta técnica representa un enfoque in vitro popular para estudiar la pérdida auditiva neurosensorial.
Esto se puede utilizar para establecer modelos ototóxicos, realizar análisis estructurales, evaluar vías de señalización y realizar estudios de detección de fármacos. En principio, este método se puede aplicar a diferentes explantes de tejidos. También se puede emplear en la investigación del oído interno para obtener información sobre las etapas de desarrollo embrionario.
Para comenzar, coloque la cabeza de la rata decapitada en la almohadilla estéril. Use tijeras y fórceps para quitar la mandíbula, luego levante la piel y retírela del cráneo. Coloque las pinzas en las cavidades orbitarias para sujetar el cráneo.
Con una hoja de bisturí afilada, corte con cuidado el cráneo a lo largo de la sutura sagital y luego el área de la sutura coronal sin dañar la cóclea. Ahora, retira el cerebro de las dos mitades del cráneo. Bajo el microscopio, localice la cóclea en el hueso temporal y afloje el tejido circundante entre la cóclea y el hueso temporal.
A continuación, coloque las pinzas en el canal semicircular superior. Separe suavemente el hueso temporal de la cóclea y sostenga la cóclea unida al vestíbulo con el hueso temporal. Inserte las puntas de las pinzas en la región del ápice, que es visible como una línea blanca, y retire la cápsula coclear cartilaginosa pieza por pieza para exponer el conducto coclear.
Coloque las pinzas debajo de la cóclea y sepárelas del órgano vestibular y del hueso temporal. Transfiera la cóclea a un plato nuevo de 60 milímetros que contenga PBS helado. Para aislar los órganos del explante de Corti, sostenga el órgano en la base y el conducto coclear en la región del gancho basal, y desenrolle suavemente el conducto coclear del modiolo sin desgarrarlo.
A continuación, sujete el conducto coclear por la base y retire el ligamento espiral y la estría vascular. Para aislar los explantes cocleares, use fórceps para separar el ganglio espiral de la lámina espiral ósea y desenrolle el modiolo durante el desprendimiento. Con unas pinzas, agarre la región del gancho y retire el ligamento espiral con la estría vascular.
Además, retire la membrana de Reissner pieza por pieza. Para transferir los explantes cocleares, sumerja una espátula de laboratorio en el plato que contiene el explante. Levante el explante con las células ciliadas hacia arriba junto con unos microlitros de PBS agitando una espátula.
Coloque el explante en un portaobjetos de cámara de ocho pocillos agitando suavemente la espátula en el medio. Deje que el explante se deslice dentro de la cámara. Con una pipeta de 100 microlitros, retire 80 microlitros de medio y deséchelo.
Compruebe la visibilidad de las células ciliadas y las células de las neuronas ganglionares espirales bajo el microscopio. Si es necesario, use fórceps para separar el tejido superpuesto. Retire el medio restante del pozo.
El explante ahora quedará más plano en la superficie de la cámara. Después de 10 segundos, pipetee una o dos gotas del medio justo al lado del explante, y el medio restante a cierta distancia para evitar el desprendimiento del explante. Asegúrese de que los explantes no se muevan mientras agrega el medio.
Incuba la cámara durante dos horas para unir los órganos firmemente al fondo de la cámara. Después de la incubación, aspire el medio. Y con una pipeta de 100 o 200 microlitros, agregue con cuidado 300 microlitros de medio completo fresco y precalentado.
Las imágenes microscópicas confocales del disco giratorio mostraron que el órgano de rata de los explantes de Corti mantuvo su estructura y longitud total tanto en condiciones normales como estresadas. Además, un microscopio confocal de barrido demostró que las células ciliadas supervivientes de los explantes de los órganos de los ratones junto con las células ciliadas que sufrían apoptosis. El protocolo permitió la monitorización de los procesadores biológicos en células cocleares vivas utilizando sondas permeables a las células adecuadas y un microscopio confocal de disco giratorio.
El cultivo de estos explantes cocleares mejora el análisis de la interacción entre las células ciliadas y las células ganglionares espirales. Las células ciliadas de los implantes cocleares se detectaron con el marcador de células ciliadas, MYO7A. Del mismo modo, se identificaron cuerpos de células ganglionares espirales sanos y dañados y neuritas utilizando el marcador neuronal, Tuj 1.
En la descripción ampliada, los cuerpos celulares de las células ciliadas marcadas con el anticuerpo MYO7A eran visibles. Se identificaron estereocilios de células ciliadas externas e imágenes deconvoneadas de estereocilios individuales de células ciliadas internas marcadas con faloidina. Se debe tener cuidado durante los procedimientos bajo el microscopio, especialmente al separar el ganglio espiral de la lámina espiral ósea.
Los explantes intactos deben transferirse y alinearse con cuidado. Este protocolo optimizó los estudios in vitro en explantes del oído interno. Los resultados de estos estudios, como las vías de señalización y la toxicidad de los fármacos, pueden guiar el diseño de estudios in vivo posteriores.
