Comience esterilizando los portaobjetos recubiertos de politetrafluoroetileno o PTFE sumergiéndolos en etanol al 70% durante 10 minutos en un gabinete de bioseguridad. Deje que los portaobjetos se sequen al aire en una placa estéril de cultivo celular de 100 milímetros. Coloque cada portaobjetos en 1 nueva placa de cultivo celular de 100 milímetros y agregue 200 microlitros de medio de cultivo celular que contenga suero en cada rectángulo.
Luego coloque una luz UV portátil de 254 nanómetros en el plato de cultivo celular de 100 milímetros con la bombilla directamente hacia el portaobjetos durante 20 minutos. Descongele las alícuotas congeladas de los segmentos externos, o OS, en un baño de agua de 37 grados centígrados. Luego gire el sistema operativo a 2, 400G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Aspirar inmediatamente el sobrenadante en el gabinete de bioseguridad con una pipeta y volver a suspender el sistema operativo en PBS. Ahora, aspire el medio de los portaobjetos y coloque hasta 500 microlitros de la solución PBS de 2 x 10 a 8º OS por mililitro de la solución PBS de 2 x 10 a 8º OS por mililitro en cada rectángulo de diapositiva. Coloque una luz UV portátil de 254 nanómetros sobre el plato de cultivo celular con la bombilla directamente hacia el sistema operativo durante 40 minutos.
Recoja la solución OS-PBS en un tubo de 1,5 mililitros. Lave el rectángulo del portaobjetos recubierto con 200 a 500 microlitros de PBS y recoja cada lavado en el tubo de microcentrífuga. Luego gire la solución OS-PBS a 2, 400G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Aspirar el PBS en el gabinete de bioseguridad con un pipeteo y resuspender el pellet en 500 microlitros de medio estándar para ser utilizado para el epitelio pigmentario de la retina, o cultivos de EPR. Coloque 10 microlitros de la suspensión en un nuevo tubo de microcentrífuga. Diluir de 50 a 100 veces con más medio de cultivo celular y contar la SG con un hemocitómetro.
Diluir la OS fotooxidada, o suspensión OxOS, a una concentración de 5.6 x 10 a la 7ª OS por mililitro en un medio RPE estándar. Agregue ligandos puente de fagocitosis, que facilitan la absorción de SG y la acumulación de lipofuscina. Luego alícuota OxOS en existencias de un solo uso y congelar a presión en nitrógeno líquido.
Descongelar las alícuotas de OxOS diluyendo la alícuota congelada en 45 microlitros de medios de cultivo celular antes de agregarla a los pozos de RPE para inducir la acumulación de lipofuscina. Luego caracterice el sistema operativo oxidado midiendo el espectro de emisión de OxOS utilizando el escaneo Lambda en un microscopio confocal. Las imágenes confocales mostraron que la SG tratada había aumentado la autofluorescencia en comparación con la SG no tratada.
