Agradecemos al núcleo histológico del Instituto Nacional del Ojo (NEI) por el uso del sistema confocal Zeiss. Este trabajo fue apoyado por los fondos NEI IRP (número de subvención ZIA EY000533-04).

Modelado y análisis de la degeneración de la retina

<ol>
	<li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899 (2017).</li><li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis.">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration:+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies.">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li><li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch's+membrane+and+choroid.">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li><li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy.">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li><li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration.">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model.">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293 (2021).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+(Y402H)+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure.">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li><li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582 (2022).</li><li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization.">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li><li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years,+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020:+the+Right+to+Sight:+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li></ol>

Sin divulgaciones.

Este protocolo proporciona un método para etiquetar, obtener imágenes y cuantificar eficientemente los depósitos de lípidos en modelos de enfermedades in vitro monogénicas y poligénicas para enfermedades oculares degenerativas. El software basado en IA, LipidUNet, se puede aplicar a tres marcadores lipídicos comunes, APOE, Nile Red y BODIPY, y proporciona un método rápido y automático para el análisis que permite que la cuantificación sea estándar e imparcial.
La principal limitación de LipidUNet es el hecho de que el conjunto de datos de entrenamiento para la IA se limitó a imágenes de aumento de 40x de células cultivadas en una placa de 96 pocillos. Como resultado del conjunto de imágenes de entrenamiento, LipidUNet, en su forma actual, se limita a analizar imágenes de aumento de 40x. El software se puede utilizar para analizar imágenes 40x de células cultivadas en otras superficies de cultivo además de una placa de 96 pocillos, pero se debe tener cuidado de examinar las máscaras de salida generadas para verificar el umbral preciso por parte del software. Se necesitarán más conjuntos de imágenes (con diferentes aumentos) para ampliar el alcance de las muestras / imágenes que puede analizar.
El protocolo tiene varios pasos críticos. En el paso del marcador lipídico, el usuario debe confirmar que su compuesto de etiquetado elegido (BODIPY, APOE, Nile Red) ha etiquetado su muestra de manera efectiva. Las células maduras del EPR a menudo están muy pigmentadas, lo que puede afectar la señal fluorescente de la inmunotinción de anticuerpos. Cuando la señal de fluorescencia es débil o cuando hay demasiada tinción de fondo, LipidUNet no puede discernir las gotas de lípidos con precisión. Por una razón similar, se deben usar los ajustes de adquisición seleccionados correctamente para el paso de creación automática de imágenes del protocolo. Si las imágenes adquiridas son de mala calidad, LipidUNet tendrá dificultades para enmascarar adecuadamente las imágenes y, por lo tanto, la cuantificación será inexacta (Figura 6A-L). Finalmente, el post-procesamiento de las imágenes es un paso importante, ya que LipidUNet tiene requisitos específicos para que el software funcione.
En comparación con los flujos de trabajo para el análisis de lípidos que utilizan umbrales manuales, o técnicas que implican umbrales automáticos en software como Fiji, LipidUNet ofrece una segmentación no sesgada y confiable a través de imágenes con deposición de lípidos variable, como se refleja en una pequeña tasa de error en la identificación de partículas lipídicas (Figura 7). El software permite al usuario la entrada de imágenes de entrenamiento adicionales, lo que permite el análisis de conjuntos de imágenes más allá de aquellos que utilizan un objetivo de aumento de 40x o incluso aquellos que utilizan un marcador lipídico diferente, como se describe en el protocolo. En el futuro, el software será entrenado para analizar imágenes 3D de modo que sea posible la cuantificación del volumen del depósito lipídico. Las enfermedades oculares degenerativas que implican la deposición de lípidos como un importante contribuyente a la patología son prevalentes, y se prevé que los casos aumenten a medida que la población de ancianos se expanda13. Los modelos precisos de la enfermedad y las herramientas de análisis eficientes, como hemos descrito en este protocolo, permitirán el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas.

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa de células ubicadas en la parte posterior del ojo adyacentes a los fotorreceptores de la retina. RPE juega un papel vital en el mantenimiento de una visión adecuada al proporcionar apoyo metabólico y estructural a los fotorreceptores. Las células sanas del EPR se caracterizan por una morfología hexagonal distinta. Están conectados por uniones estrechas, que permiten que el EPR actúe como una barrera entre el coriocapilar ubicado en su lado basal y los fotorreceptores ubicados apicalmente. Para mantener el ecosistema retiniano, el EPR transporta metabolitos clave, por ejemplo, glucosa, a los fotorreceptores de una manera que minimiza el consumo de glucosa en el EPR1. Debido a esta limitación, el EPR depende de otros metabolitos para mantener sus necesidades metabólicas, incluidos los ácidos grasos, que el EPR convierte en cetonas a través de la β-oxidación2. Dada la propensión del EPR a utilizar ácidos grasos, que probablemente se reciclan de la digestión del segmento externo de los fotorreceptores (POS), como fuente de energía, los cambios perjudiciales en las vías de procesamiento de lípidos en el EPR a menudo conducen a, o están implicados en, enfermedades degenerativas de la retina monogénicas y poligénicas3.
La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), una enfermedad ocular degenerativa poligénica que causa la degeneración del EPR, también se ha relacionado con la autofagia aberrante y el metabolismo de los lípidos en la monocapa del EPR. La falla de una monocapa de EPR disfuncional para procesar POS y realizar otras funciones críticas conduce a depósitos extracelulares (sub-RPE) llamados depósitos lineales basales (BLinD) ubicados entre el EPR y la membrana de Bruch, un sello distintivo de las patologías de DMAE. Los principales componentes de BLinD incluyen lipoproteínas, la más abundante de las cuales es la apolipoproteína E (APOE)4. La acumulación de capas delgadas de BLinD puede conducir a drusas blandas, que se reconoce como un síntoma clínico de AMD 5,6.
Varios grupos han demostrado que los modelos de enfermedad in vitro derivados de células madre que causan disfunción del EPR presentan acumulación de lípidos sub-EPR 7,8,9. Hallam et al. (2017) generaron RPE derivado de células madre pluripotentes inducidas (iRPE) de pacientes con un alto riesgo de DMAE debido a un polimorfismo del gen CFH. El iRPE mostró acumulación de drusas, marcada por APOE, y el RPE de alto riesgo acumuló depósitos mayores que el iRPE generado a partir de pacientes de bajo riesgo10.
Para crear un modelo in vitro que recapitule las características celulares de la DMAE, como las gotas de lípidos y la deposición de drusas, se establecieron líneas de iRPE generadas a partir de muestras de sangre de pacientes utilizando un protocolo guiado por el desarrollopreviamente publicado 11. Los iRPE fueron sometidos a suero humano competente para el complemento (CC-HS), una solución que contiene anafilatoxinas que imitan una posible causa de DMAE: aumento de la señalización alternativa del complemento8. La deposición celular y subcelular resultante de depósitos de lípidos se midió utilizando marcadores lipídicos y lipoproteicos de uso común, APOE, Nile Red y BODIPY. A través de estos marcadores, se demostró que la señalización activada del complemento a través de CC-HS exacerbó la acumulación de lípidos en las células iRPE8.
Para desarrollar un modelo de enfermedad para una enfermedad degenerativa retiniana monogénica, se desarrollaron líneas iRPE a partir de pacientes con enfermedad de Stargardt, una enfermedad causada por mutaciones en el gen ABCA4 en RPE. Se ha demostrado previamente que cuando ABCA4 es eliminado, la lipofuscina A2E, un depósito intracelular conocido por contener altos niveles de fosfolípidos y productos de peroxidación lipídica dependientes de la luz, se acumula dentro del RPE12. Las líneas knockout ABCA4 se desarrollaron junto con las líneas de pacientes, y ambas fueron sometidas a alimentación POS. El Stargardt iRPE demostró patología inducida por fagocitosis POS, exhibiendo una mayor acumulación de lípidos cuantificada por la tinción BODIPY. Los EPR derivados de las iPSC ABCA4 KO se sometieron a tratamiento CC-HS; la cuantificación de la señal de BODIPY también mostró un defecto en el manejo de lípidos en el modelo de enfermedad de Stargardt9.
Dada la prevalencia de estas enfermedades y la necesidad de terapias eficaces, junto con los modelos de enfermedad relevantes descritos anteriormente, es necesario establecer métodos sólidos para cuantificar la eficacia de los tratamientos potenciales. Para cuantificar los depósitos de lípidos de una manera objetiva, automatizada y estandarizada, se creó un software basado en el aprendizaje automático, LipidUNet, para que, cuando se combina con herramientas de análisis de máscaras, la deposición de lípidos se pueda identificar de manera rápida y efectiva utilizando los marcadores comunes Nile Red, BODIPY y APOE. Las estadísticas resumidas obtenidas utilizando esta tubería de análisis se pueden analizar y mostrar gráficamente, lo que permite una fácil comparación de las condiciones de tratamiento. El esquema del protocolo se muestra en la Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del protocolo: las células del EPR se cultivan en una placa de 96 pocillos y se desafían con suero humano activo o segmentos externos bovinos purificados para modelar diferentes tipos de degeneraciones retinianas in vitro. Las células del EPR se fijan y tiñen para depósitos de lipoproteínas con Nile Red, BODIPY y APOE. Se utiliza un microscopio confocal para adquirir pilas Z de partículas lipídicas marcadas con fluorescencia, que posteriormente se procesan en proyecciones de intensidad máxima 2D. Se entrenó un algoritmo de aprendizaje automático para reconocer y segmentar correctamente las partículas de lipoproteínas. Se generan tablas de resumen que contienen el recuento de partículas y varias métricas de forma que se pueden utilizar para el trazado posterior y el análisis estadístico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Steriflip filter system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine, Fraction V</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21431</td>
			<td>APOE secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOE primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complement competent human serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1-LITER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71870-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Alpha</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod Outer Segments (OS)</td>
			<td>InVision Bioresources</td>
			<td>98740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Ultrapure</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14701SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidunet-machine learning-based method of characterization and quantification of lipid deposits using ipsc-derived retinal pigment epithelium

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa de células hexagonales ubicadas en la parte posterior del ojo. Proporciona alimento y apoyo a los fotorreceptores y capilares coroideos, realiza fagocitosis de segmentos externos fotorreceptores (POS) y secreta citoquinas de manera polarizada para mantener la homeostasis de la retina externa. El EPR disfuncional, causado por mutaciones, envejecimiento y factores ambientales, resulta en la degeneración de otras capas de la retina y causa pérdida de la visión. Una característica fenotípica distintiva de la degeneración del EPR son los depósitos ricos en lípidos intra y subcelulares. Estos depósitos son un fenotipo común en diferentes enfermedades degenerativas de la retina. Para reproducir el fenotipo de depósito lipídico de las degeneraciones retinianas monogénicas in vitro, se generó RPE derivado de células madre pluripotentes inducidas (iRPE) a partir de los fibroblastos de los pacientes. Las líneas celulares generadas a partir de pacientes con Stargardt y enfermedad de degeneración retiniana de inicio tardío (L-ORD) se alimentaron con POS durante 7 días para replicar la función fisiológica del EPR, lo que causó la patología inducida por fagocitosis POS en estas enfermedades. Para generar un modelo para la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), una enfermedad poligénica asociada con la activación alternativa del complemento, el iRPE fue desafiado con anafilatoxinas alternativas del complemento. Los depósitos lipídicos intra y subcelulares se caracterizaron utilizando rojo del Nilo, boro-diprometeno (BODIPY) y apolipoproteína E (APOE). Para cuantificar la densidad de los depósitos lipídicos, se desarrolló un software basado en el aprendizaje automático, LipidUNet. El software fue entrenado en imágenes de proyección de máxima intensidad de iRPE en superficies de cultivo. En el futuro, será entrenado para analizar imágenes tridimensionales (3D) y cuantificar el volumen de gotas de lípidos. El software LipidUNet será un recurso valioso para descubrir fármacos que disminuyan la acumulación de lípidos en modelos de enfermedades.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of cells located in the back of the eye adjacent to retinal photoreceptors. RPE plays a vital role in maintaining proper vision by providing metabolic and structural support to the photoreceptors. Healthy RPE cells are characterized by a distinct hexagonal morphology. They are connected by tight junctions, which allow the RPE to act as a barrier between the choriocapillaris located on its basal side and photoreceptors located apically. To maintain the retinal ecosystem, RPE shuttles key metabolites, e.g., glucose, to photoreceptors in a way that minimizes glucose consumption in the RPE1. Due to this limitation, RPE depends on other metabolites to maintain their metabolic needs, including fatty acids, which RPE converts to ketones through &#946;-oxidation2. Given the propensity of RPE to utilize fatty acids, which are likely recycled from photoreceptor outer segment (POS) digestion, as an energy source, detrimental changes to the lipid processing pathways in RPE often lead to, or are implicated in, both monogenic and polygenic degenerative retinal diseases3.
Age-related macular degeneration (AMD), a polygenic degenerative eye disease that causes RPE degeneration, has also been linked to aberrant autophagy and lipid metabolism in the RPE monolayer. The failure of a dysfunctional RPE monolayer to process POS and perform other critical functions leads to extracellular (sub-RPE) deposits called basal linear deposits (BLinD) located between the RPE and Bruch&#39;s membrane - a hallmark of AMD pathologies. Major components of BLinD include lipoproteins, the most abundant of which is apolipoprotein E (APOE)4. Accumulation of thin layers of BLinD can lead to soft drusen, which is recognized as a clinical symptom of AMD5,6.
Several groups have shown that stem cell-derived in vitro disease models that cause RPE dysfunction feature sub-RPE lipid accumulation7,8,9. Hallam et al. (2017) generated induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) from patients with a high risk for AMD due to a polymorphism of the CFH gene. The iRPE showed drusen accumulation, as marked by APOE, and the high-risk RPE accumulated larger deposits than iRPE generated from low-risk patients10.
To create an in vitro model that recapitulates cellular hallmarks of AMD, such as lipid droplets and drusen deposition, iRPE lines generated from patient blood samples were established using a previously published developmentally guided protocol11. The iRPE were subjected to complement-competent human serum (CC-HS), a solution containing anaphylatoxins that mimic one possible cause of AMD: increased alternate complement signaling8. The resulting cellular and sub-cellular deposition of lipid deposits was measured using commonly used lipid and lipoprotein markers, APOE, Nile Red, and&#160;BODIPY. Through these markers, it was shown that activated complement signaling via CC-HS exacerbated lipid accumulation in iRPE cells8.
To develop a disease model for a monogenic retinal degenerative disease, iRPE lines were developed from patients with Stargardt disease, a disease caused by mutations to the ABCA4 gene in RPE. It has previously been shown that when ABCA4 is knocked out, A2E lipofuscin, an intracellular deposit known to contain high levels of phospholipids and light-dependent lipid peroxidation products, accumulates inside the RPE12. ABCA4 knockout lines were developed alongside the patient lines, and both were subjected to POS feeding. The Stargardt iRPE demonstrated POS phagocytosis-induced pathology, exhibiting increased lipid accumulation quantified by BODIPY staining. RPE derived from ABCA4 KO iPSCs were subjected to CC-HS treatment; quantification of the BODIPY signal showed a defect in lipid handling in the Stargardt disease model as well9.
Given the prevalence of these diseases and the need for effective therapeutics, along with the relevant disease models described above, there is a need to establish robust methods for quantifying the efficacy of potential treatments. To quantify lipid deposits in a way that is objective, automated, and standardized, a machine-learning-based software, LipidUNet, was created so that, when paired with mask analysis tools, lipid deposition can quickly and effectively be identified using the common markers Nile Red, BODIPY, and APOE. The summary statistics obtained using this analysis pipeline can then be analyzed and displayed graphically, allowing for easy comparison of treatment conditions. The schematic of the protocol is shown in Figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic of the protocol: RPE cells are grown on a 96-well plate and challenged with active human serum or purified bovine outer segments to model different types of retinal degenerations in vitro. RPE cells are fixed and stained for lipoprotein deposits with Nile Red, BODIPY, and APOE. A confocal microscope is used to acquire Z-stacks of fluorescently-labeled lipid particles, which are subsequently processed into 2D maximum intensity projections. A machine-learning algorithm was trained to recognize and correctly segment lipoprotein particles. Summary tables containing particle count and various shape metrics are generated and can be used for subsequent plotting and statistical analysis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor destacado: Desentrañar la patogénesis de la degeneración macular relacionada con la edad y descubrir posibles terapias 

LipidUNet-Machine Learning Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

In this study, we aim to understand the age-related macro degeneration pathogenesis and find the potential treatment for it. This semi-automated pipeline for lipid droplet analysis provides a robust system to study metabolism and aging diseases. Our lab focuses on finding drug targets for the treatment of AMD either using genetic or small molecule screens that aimed at reducing the accumulation of lipid deposits.

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo para identificar depósitos de lípidos teñidos por Nile Red, BODIPY y APOE. El software desarrollado puede identificar y cuantificar automáticamente los depósitos de lípidos y funciona mejor cuando se optimiza el protocolo descrito. Se incluyen ejemplos de EPR diferenciado con éxito (Figura 3A) y EPR pobremente diferenciado (Figura 3B), ya que la calidad del modelo celular afecta en gran medida la calidad de la segmentación adecuada de la imagen.
Dos de los tres marcadores descritos en el protocolo, Nile Red y BODIPY, se identifican como pequeños puntos circulares que son claramente brillantes en imágenes fluorescentes (Figura 5 y Figura 6). Una imagen "positiva" del protocolo sería una identificación apropiada de estos depósitos distintos (Figura 5A-D y Figura 5E-H). Un resultado "negativo" mostraría una segmentación incorrecta de la imagen al confundir la fluorescencia de fondo con un depósito, ya sea debido a una tinción débil (Figura 6A-C y Figura 6D-F) o debido a una alta intensidad de fondo (Figura 6G-I).
Los depósitos de APOE tienen una variedad de tamaños y formas, apareciendo más ovalados o irregulares en lugar de los depósitos circulares de Nile Red y BODIPY. Estos depósitos también son menos punteados, y la intensidad de la señal puede diferir entre depósitos debido a variaciones en la permeabilización de la muestra. La identificación correcta identificará cada depósito, incluidos aquellos que están menos saturados (Figura 5I-L), mientras que la segmentación incorrecta no recogerá estos depósitos (Figura 6J-L). Por lo tanto, es importante optimizar los métodos de tinción e imagen para evitar variaciones drásticas. Una forma de hacerlo es prestando especial atención a los pasos de permeabilización de la muestra durante la inmunotinción. Para optimizar la señal fluorescente, las células pueden ser lisadas antes de la fijación e inmunotinción para APOE, lo que resulta en una saturación uniforme y una mejor segmentación de los depósitos de APOE.
También se proporcionan imágenes segmentadas de células maduradas en una plataforma de cultivo que no sea una placa de 96 pocillos. El software LipidUNet se ejecutó en imágenes de células cultivadas en un pozo trans, y mientras que los depósitos de lípidos están umbralizados, también lo son los poros en la membrana del transpozo (Figura 6M-O). Debido a la similitud en forma y tamaño, el software LipidUNet en su forma actual enmascarará tanto los depósitos de lípidos como los poros transwell indiscriminadamente.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> Figura 5: Resultados representativos. (A,E,I) El EPR chapado en 96 pocillos se tiñe con tinción nuclear de Hoechst (azul) y rojo del Nilo (magenta), BODIPY (verde) o APOE (naranja) y son las proyecciones de intensidad máxima de una pila Z. (B, F, J) Las imágenes de entrada en escala de grises para el software LipidUNet después del procesamiento de imágenes. (C, G, K) Máscaras generadas por LipidUNet, donde todos los depósitos están identificados correctamente. (D,H,L) Los contornos de cada partícula enmascarada están numerados. Estas etiquetas permiten conectar cada partícula de la imagen a una entrada en el spreadheet con los datos en bruto. (A-D) muestra la tinción del Rojo del Nilo, y el software es capaz de reconocer los depósitos contra el fondo con precisión a pesar de una señal más débil. (E-H) muestra un fuerte contraste entre la señal BODIPY y el fondo, lo cual es ideal. LipidUNet identifica correctamente cada depósito en la imagen. (I-L) muestra una fuerte señal APOE y representa la variabilidad de la saturación de la señal que a menudo se ve con esta tinción. No obstante, la segmentación de imágenes es capaz de identificar los bordes de cada depósito APOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> Figura 6: Resultados subóptimos. (A,D,G,J,M) El EPR de 96 pocillos se tiñe con tinción nuclear de Hoechst (azul) y rojo del Nilo (magenta), BODIPY (verde) o APOE (naranja) y son las proyecciones de intensidad máxima de una pila Z. (B, E, H, K, N) Las imágenes de entrada en escala de grises para el software LipidUNet después del procesamiento de imágenes. (C,F,I,L,O) Las máscaras incorrectas generadas por LipidUNet. Los círculos rojos indican dónde el software ha identificado incorrectamente un depósito de lípidos. (A-C) El procesamiento de Nile Red es incorrecto porque el software ha identificado la tinción de fondo como un depósito. Esto puede suceder más a menudo cuando hay un fondo alto pero pocos depósitos de lípidos en la imagen. Se muestran dos ejemplos de tinción BODIPY: una imagen de mala calidad debido a la tinción BODIPY débil (D-F) y (G - I) una señal BODIPY fuerte con fondo alto. En ambos casos, el software es incapaz de distinguir pequeños depósitos de lípidos circulares del anillo circular de fondo que rodea el núcleo. Si bien la tinción y las imágenes deben optimizarse para evitar estos errores, la versión más reciente de LipidUNet se ha mejorado en gran medida para estas imágenes. (J-L) Segmentación incorrecta de APOE. Dado que los depósitos son más variables en tamaño y saturación de señal, el software tiene dificultades para reconocer algunos depósitos. (M-O) RPE sembrado en un pozo trans y teñido con Rojo del Nilo. Aquí se muestra una rebanada de la pila Z con depósitos de lípidos de Nile Red y poros transwell. El software es incapaz de distinguir entre los dos, como se muestra por el círculo rojo que contiene poros transwell y la flecha verde que apunta a los depósitos de Nilo Red. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> Figura 7: Comparación de herramientas de máscara. (A, B, C) El EPR de 96 pocillos con cantidades variables de deposición de lípidos se identifica con rojo del Nilo (rojo). Las imágenes se enmascaran utilizando tres métodos de enmascaramiento comunes diferentes, Find Maxima, Max Entropy y Renyi Entropy, y se comparan con la máscara generada por LipidUNet. La imagen original se acompaña de un recuento manual de los depósitos de lípidos, mientras que las máscaras muestran los recuentos previstos por cada método de segmentación. La tasa de error media se calculó para cada método de segmentación utilizando la siguiente fórmula: media[(|Recuento previsto - Recuento manual|/Conteo manual) x 100]. La máscara generada por LipidUNet identifica con mayor precisión los depósitos de lípidos en las imágenes con deposición variable en comparación con otros métodos de enmascaramiento (tasas de error promedio: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Max Entropy, 203% Renyi Entropy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Número de gato</td>
			<td>Stock Conc.</td>
			<td>Final Conc.</td>
			<td>Ml</td>
		</tr><tr><td>MEM alfa</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>Suplemento N2</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>NA</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FBS inactivado por calor</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>NA</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>NMEM NEAA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10mM</td>
			<td>0,01 mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Piruvato de sodio</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100mM</td>
			<td>1mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000u/mL</td>
			<td>100U/mL</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Taurina</td>
			<td>T4571</td>
			<td>50mg/mL</td>
			<td>250ug/mL</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>Hidrocortisona</td>
			<td>H6909</td>
			<td>18.1mg/L</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>T3</td>
			<td>T5516</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0.013ug/L</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Volumen total, ml</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Composición del reactivo RPE-MM. Una lista de reactivos y concentraciones óptimas para RPE-MM.

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Pathogenesis of Age-Related Macular Degeneration and Discovering Potential Therapies at JoVE.com

Las enfermedades oculares degenerativas que afectan la capa del epitelio pigmentario de la retina del ojo tienen orígenes monogénicos y poligénicos. Se han desarrollado varios modelos de enfermedades y una aplicación de software, LipidUNet, para estudiar los mecanismos de la enfermedad, así como posibles intervenciones terapéuticas.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

En este estudio, nuestro objetivo es comprender la patogénesis de la macrodegeneración relacionada con la edad y encontrar el tratamiento potencial para ella. Esta tubería semiautomatizada para el análisis de gotas de lípidos proporciona un sistema robusto para estudiar el metabolismo y las enfermedades del envejecimiento. Nuestro laboratorio se centra en la búsqueda de dianas farmacológicas para el tratamiento de la DMAE, ya sea mediante cribados genéticos o de moléculas pequeñas que tienen como objetivo reducir la acumulación de depósitos de lípidos.

lipidunet-machine-learning-based-method-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

1.7K vistas.  National Institutes of Health (NIH). En este estudio, nuestro objetivo es comprender la patogénesis de la macrodegeneración relacionada con la edad y encontrar el tratamiento potencial para ella. Esta tubería semiautomatizada para el análisis de gotas de lípidos proporciona un sistema robusto para estudiar el metabolismo y las enfermedades del envejecimiento. Nuestro laboratorio se centra en la búsqueda de dianas farmacológicas para el tratamiento de la DMAE, ya sea mediante cribados genéticos o de moléculas pequeñas q...

Video: Autor destacado: Desentrañar la patogénesis de la degeneración macular relacionada con la edad y descubrir posibles terapias 

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.

Investigación

Biología

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits

To begin, dissolve Nile Red powder in acetone at three milligrams per milliliter concentration. Incubate the solution for 15 minutes at room temperature with periodic mixing. Filter the solution using a 0.22-micrometer filter once or twice depending on the amount of precipitate remaining in the solution.Then prepare the working solution by diluting the stock solution at a one-to-500 ratio in DPBS. Add 200 microliters of the working solution to the paraformaldehyde-fixed RPE cells and incubate for 30 minutes at room temperature on a shaker protecting from light. After incubation, wash the samples twice with DPBS, then add 200 microliters of DPBS, and store them at four degrees Celsius.For BODIPY staining, prepare a 3.8-millimolar stock concentration by dissolving BODIPY in anhydrous DMSO. Then prepare the working solution by diluting the stock solution at a one-to-300 ratio in DPBS. Add 200 microliters of the working solution of BODIPY to paraformaldehyde-fixed RPE cells and incubate overnight on a rocker at room temperature.The next day, wash the cells twice with DPBS and add 200 microliters of DPBS before storing them at four degrees Celsius. For APOE immunostaining, prepare a buffer solution by combining DPBS with 1%BSA, 0.5%Tween 20, and 0.5%Triton X-100. Block and permeabilize the paraformaldehyde-fixed RPE cells in 200 microliters of buffer solution for one hour.After incubation, add APPLE primary antibody diluted at one-to-100 in the buffer solution and incubate overnight at room temperature. The following day, wash the samples twice with DPBS. Then add 200 microliters of secondary antibody solution diluted at one-to-1000 for one hour at room temperature.After incubation, wash the cells twice with DPBS and add 200 microliters of DPBS before storing them at four degrees Celsius.

Tinción de depósitos de epitelio pigmentario subretiniano (EPR)

Image Processing of REP Deposits, Segmentation, and Quantification

Using a confocal microscope and a 40X objective, create a scan profile with the appropriate fluorescent channels for the lipid marker used. After setting up the acquisition mode and channels, optimize the focus strategy by clicking on Software Autofocus. Then set the range of the Z Stack to 20 microns.After this, optimize tiles and open the viewer to select the tile positions. Next, using a batch image processing method, create maximum projections of each Z Stack with the extended depth of focus method. Before exporting the images, set the compression to none and ensure original data is checked.The resulting image is a maximum projection gray scale TIFF of only the fluorescence channel, expressing the lipid marker. Identify the TIFF images representing either Nile Red, BODIPY, or APOE and move them into the Images folder within a directory named either Nile Red, BODIPY, or APOE, depending on the method being used. Open the lipid unit software.In the Predict tab, select the relevant directory by clicking on the ellipsis and navigating to the named directory. Confirm that lipid unit has identified the images correctly by checking the class entry. Click Predict to observe the task progress, then using the Mask Analysis tool, iterate through the generated masks and provide a quantitative count of the threshold lipid deposits from the mask images.Successful differentiation and maturation of RPE showed a confluent monolayer with pigmentation and polygonal morphology. In contrast, unsuccessful differentiation showed clusters of dying cells. In fluorescent images, Nile Red and BODIPY deposits appeared as small, bright circular points.A negative result shows incorrect image segmentation by mistaking background fluorescence as a deposit, either due to weak staining or high background intensity. APOE deposits varying in size, shape, and signal intensity and requiring optimization of staining and imaging methods to minimize variation are shown.