Este trabajo fue apoyado por la Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs a EFN), Fondation Voir et Entendre y Fondation Bettencourt Schueller (Becas a Jóvenes Investigadores a EFN), Centro Nacional de la Recherche Scientifique (CNRS, puesto permanente para EFN) , y el Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud (R01-EY13295 a SCF). Además, el Instituto de la Visión es financiado por el Institut National de la Santé et de la Investigación Médica, Universidad Pierre et Marie Curie en París 6, Centro Nacional de la Investigación Científica y el departamento de París.

Este aislamiento experimento POS es mucho tiempo y puede requerir hasta 12 horas para completar si POS están etiquetados antes de su almacenamiento. El protocolo ha sido adaptado de un artículo publicado por RS Molday y sus colegas en 1987 31 y modificado por SC Finnemann y sus colegas en 1997 10. Los animales fueron manejados de acuerdo a la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research. Protocolos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Charles Darwin Pierre y Marie Curie de París-06 y el Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Fordham. 1. Configuración General <ol><li> Obtener 80 frescos de cerdo o vaca ojos tan frescos, tan pronto después de la matanza como sea posible y mantenerlos refrigerados en la oscuridad. Proporcionar instrucciones al proveedor para que la empresa procede de la misma manera. Este protocolo está optimizado para 80 ojos. Aproceder con más ojos y obtener las reservas más grandes (por ejemplo, desde 160 ojos), el doble de las cantidades de solución y realizar 2 rondas de ultracentrifugación; muestras de la piscina después en la etapa de recolección (ver paso 2.2.2). </li><li> Establecer en el banco de la lámpara de luz de seguridad roja, almohadillas absorbentes, trapos (tabla Materiales). Preparar 15 cm de platos y bolsas de bioseguridad para la recogida de residuos (las partes del ojo no utilizado, vítreos ...). Use bata ajustada, guantes, protectores de mangas y gafas. </li><li> Precauciones: <ol><li> Pre-enfriar todas las soluciones luego mantenerlos fríos durante todos los pasos. Mantener los ojos y los gradientes enfrió en hielo tanto como sea posible. </li><li> Mantener los ojos y tejidos derivados en la oscuridad tanto como sea posible hasta que la etapa de recogida después de la ultracentrifugación para evitar photobleaching de pigmentos visuales y la pérdida de la color naranja-rosa de la forma activa de los fotopigmentos. </li></ol></li></ol> 2. Protocolo de acciones <ol><li> Preparar soluciones y gradientes: <ol><li> Taurina deshielo stock completamente utilizando un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Preparar todas las soluciones de soluciones madre (Tabla 1, las soluciones madre) y mezclar bien la sacarosa con otros ingredientes usando un agitador magnético para cada solución. <ol><li> Preparar 15 ml de la solución de homogeneización a una concentración final de 20% de sacarosa, 20 mM Tris pH 7,2 de etilo, 2 mM MgCl2, 10 mM de glucosa y 5 mM de taurina. </li><li> Preparar la solución de sacarosa al 25% a una concentración final de 25% de sacarosa (usando 70% stock sacarosa), 20 mM de acetato de tris pH 7,2, 10 mM de glucosa y 5 mM de taurina. </li><li> Preparar la solución de sacarosa al 60% a una concentración final de 60% de sacarosa (usando polvo de sacarosa), 20 mM de Tris pH 7,2 etilo, glucosa 10 mM y 5 mM de taurina. </li><li> Preparar la solución de lavado 1 a una concentración final de 20 mM de acetato de tris pH 7,2 y 5 mM de taurina. </li><li> Prepare la solución de lavado 2a una concentración final de 10% de sacarosa, 20 mM de acetato de tris pH 7,2 y 5 mM de taurina. </li><li> Preparar la solución de lavado 3 a una concentración final de 10% de sacarosa, 20 mM de fosfato de sodio pH 7,2 taurina y 5 mM. </li></ol></li><li> Estabilizar el fabricante de gradiente en un agitador magnético e insertar una barra de agitación en la cámara más cercana a la salida donde se insertará la solución al 60%. Utilice una punta de pipeta P200 de corte colocado en la salida de la tubería para lograr velocidad de colada adecuada. </li><li> Reparto de degradados lineales delicadamente diluyendo y agitando la solución de sacarosa al 60% con el 25% uno usando 12 ml de cada solución (es decir, un total de 6 tubos de 80 ojos) en tubos de ultracentrífuga pre-enfriados. Agitar la solución gradualmente-diluyendo sacarosa 60% también. Estabilizar la velocidad del flujo de gradiente, vertiendo la solución de problemas y no demasiado rápido. NOTA: A fin de obtener un gradiente continuo, lineal, mantenga la abertura de la punta de la pipeta a la derecha en la superficie de la solución para toda la formatio gradienten. </li><li> Deje que los gradientes se sientan en hielo durante alrededor de 1 hora para la estabilización. Mantenga los gradientes de temperatura hasta cargado. No agite los tubos para evitar la interrupción de la pendiente. </li></ol></li><li> Colección de tejidos: <ol><li> Recoge los tejidos bajo la luz roja tenue. Tome un ojo en una mano y empuje la parte delantera con el borde de la hoja de afeitar mientras sostiene el ojo lejos (para evitar salpicaduras; Figura 1). Utilice la hoja de afeitar para cortar el globo ocular anterior en 2 mitades (córnea, además de al menos 5 mm en la esclerótica). Retire el objetivo y voltear la ojera adentro hacia afuera de modo que se hace sobre la punta de un dedo exponiendo así a la retina. </li><li> Uso de la hoja de afeitar en un ángulo, raspar suavemente la retina, desprendimiento fácil y que aparece como una capa de color rosado, fuera de la superficie tapetum y cortes en la cabeza del nervio óptico (Figura 1). Recoge todas las retinas en 2 x 50 ml tubos que contienen cada uno 15 ml de solución de homogeneización en hielo. </li><li> Homo Retinahomoge-: <ol><li> Agitar la suspensión vigorosamente a mano durante 2 min con el fin de interrumpir las diferentes capas de células, romper POS fuera el resto de la célula PR, fragmento de POS y homogeneizar la suspensión retina. </li><li> Filtro 3x a través de una doble capa de gasa limpia para eliminar fragmentos de tejido grandes y recoger el flujo a través de limpias tubos de 50 ml (Figura 1). La suspensión de la retina de ser bastante grueso, para maximizar el rendimiento, presione suavemente sobre la gasa para liberar los tejidos restantes fragmentados después de cada filtración. </li></ol></li></ol></li><li> Fotorreceptor exterior fragmento segmento (POS) Aislamiento: <ol><li> Coloque con cuidado la preparación retina crudo, alrededor de 6-7 ml por tubo, más de 6 x 30 ml tubos de ultracentrífuga conteniendo cada uno 24 ml de frío continuo fresca 25 - gradiente de sacarosa al 60% (Figura 1). Equilibre los tubos opuestas que sean procedentes para el rotor que se utilizará. Ultracentrífuga a 106.000 xg durante 50 min a 4 ° C. </li&gt; <li> Eliminar la mayor parte de la solución encima de la banda de color naranja-rosa en el tercio superior del gradiente por aspiración (Figura 2A). Recoger la banda de color naranja-rosa con una punta P1000 de corte en un vaso. Deseche el resto después de neutralizar el uso de cloro (residuos biológicos). </li><li> Diluir con ~ 4 - 5 volúmenes de helado Wash 1 solución. Separar en tantos tubos de 30 ml, según sea necesario. Centrifugar a 3000 xg durante 10 min a 4 ° C. Elimine con cuidado el sobrenadante. </li><li> Pellets de resuspender en 10 ml lavado 2 solución y centrifugado a 3000 xg durante 10 min como se detalló anteriormente. Bolitas Resuspender en 15 ml de lavado 3 y girar de nuevo a 3.000 g durante 10 min. Combinar suspensiones de varias bolitas para reducir el número de tubos necesarios antes de la centrifugación en Wash 2 y 3 Lave soluciones. </li></ol></li><li> POS alicuotear sin etiquetado: <ol><li> Resuspender POS en 10-20 ml de DMEM. Prediluya 10 l en 490 l DMEM (1:50) y el recuento alargado, así como POS giró en uncámara de recuento de células (Figura 2B). Calcular el rendimiento y la concentración en partículas POS por ml. NOTA: El rendimiento varía, dependiendo principalmente de la edad y cepa de cerdos / vacas y el tamaño de los ojos, por ejemplo, una buena preparación varía de 5 - 8 x 10 ojos 9 POS de 80 cerdos. </li><li> Decidir sobre el volumen de DMEM final (típicamente 10 a 20 ml) y se añade sacarosa para producir una concentración final de 2,5% de sacarosa. </li><li> Preparar alícuotas del tamaño deseado, por ejemplo, 5 x 10 7 POS por tubo para un volumen de resuspensión 2 ml para un experimento de 96 pocillos a 40 l / pocillo. Tirada 1 alícuota durante 5 min a 2300 xg a TA y evaluar el tamaño del pellet. Preparar alícuotas diferentes tamaños para diferentes volúmenes de aplicación como POS NO debe congelarse y descongelarse dos veces. </li><li> Congele alícuotas POS a -80 ° C hasta su uso posterior. NOTA: Las alícuotas son estables durante muchos meses. En nuestras manos, no marcado o etiquetado POS se puede almacenar durante al menos un año. </li></ol></li><li> Etiquetado POS y alícuotas: NOTA: normalmente utilizamos FITC para etiquetar POS para la cuantificación de ensayos de fagocitosis, pero otros colorantes se pueden usar también en función de las necesidades. <ol><li> Resuspender 1 10 mg vial FITC a una / ml de concentración 2,5 mg en 0,1 M tampón de carbonato de Na pH 9,5 mediante la mezcla de 2,6 ml 0,1 M de NaHCO3 pH 8,4 con 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (tabla 2, las soluciones de archivo). Girar durante 1 hora a RT mientras se protege de la luz y de centrifugado durante 5 min a velocidad máxima para sedimentar los sólidos FITC no resuspendidas. </li><li> Resuspender el precipitado POS en 10 ml de Wash 3 solución (o DMEM) y añadir 2 ml de solución de FITC durante 80 ojos. Guarde las sobras FITC congelado a -80 ° C. Rotar durante al menos 1,5 horas a RT. Proteger de la luz utilizando papel de aluminio. </li><li> Lave POS marcado dos veces utilizando Wash solución 3 como se describe en la sección 2.3.4, a continuación, una o dos veces en DMEM hasta que casi no FITC libre se ve en el sobrenadante fraction. Resuspender POS en DMEM y proceda como para POS sin etiqueta para contar y alícuotas (sección 2.4). </li></ol></li><li> Uso de POS en los experimentos: <ol><li> POS Descongelar a temperatura ambiente, y mantenerlos en la oscuridad tanto como sea posible si están etiquetados con fluorescencia. Haga girar durante 5 minutos a 2300 xg a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante. </li><li> Inmediatamente resuspender en volumen apropiado de solución de ensayo según lo dictado por el experimento. En caso de diferentes tiempos de desafío POS, POS tienda volvió a suspender a TA en la oscuridad entre los puntos de tiempo durante varias horas. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Tres pasos o condiciones son cruciales para una purificación optimizada: la calidad de la fundición de gradiente y delicada manipulación de tubos de gradiente, manteniendo los tejidos refrigerada y en la oscuridad hasta la etapa de recogida, la fuerza de agitación de homogeneizados de la retina para obtener el aislamiento POS adecuada del resto de la PR célula. Si surge algún problema en ver a la banda naranja correctamente, son muy probablemente debido a una de las tres razones anteriores (véase también el segu...

En la retina, la visión se activa por isomerización de moléculas fotosensibles llamadas opsinas, antes de ser transformada en una señal que puede ser transmitida entre las neuronas hasta las áreas visuales del cerebro. Estas moléculas están incrustados en las pilas de discos membranosos asemejan panqueques que constituyen las porciones de segmentos externos de las células fotorreceptoras (RP). Ser sometido a la exposición constante a la luz y por lo tanto los niveles considerables de estrés oxidativo, RP renovar continuamente sus segmentos externos para limitar el daño oxidativo potencial. Segmentos externos de los fotorreceptores están en estrecho contacto con microvellosidades apicales de las células vecinas del epitelio pigmentario de la retina (RPE). RPE células constituyen la parte exterior de la barrera hemato-retiniana y aseguran numerosas tareas que son cruciales para la salud y la función de los fotorreceptores 1, tales como apagar los rayos de luz a través de pigmentos de melanina, re-isomerización de la retina componente opsina fotoreactivo, proporcionando nutrientes y grecimiento factores, participando en disposición PR metabolito. Además, las células RPE eliminan pasaron POS y reciclan sus componentes, una ocupación diaria que está regulado por el ritmo circadiano en la retina de mamíferos 2,3. El aclaramiento de cobertizo POS es absolutamente necesario para la supervivencia de relaciones públicas. Cuando esté completamente abrogada, POS se acumulan escombros y RP degeneran causando una rápida 4,5 pérdida de visión. Si el perfil rítmico se pierde y se sustituye por una actividad constante, PR y RPE defectos se acumulan con la edad 6. Por lo tanto, es muy importante para caracterizar la regulación molecular de la fagocitosis RPE in vitro con el fin de entender fenotipos vinculados a su disfunción. Curiosamente, la maquinaria molecular en las células RPE es muy similar a la utilizada por los macrófagos para eliminar las células apoptóticas y ambos son dependientes de reconocimiento de fosfatidilserina expuesta sobre los desechos fagocítica 7-9. Sin embargo, las células RPE y macrófagos regular el pHagocytosis diferente, como macrófagos optan por la eliminación inmediata de las células apoptóticas en tiempo de encuentro, mientras que las células del EPR rítmicamente engullir POS sólo una vez al día a pesar de su permanente contacto con los segmentos externos. Esto sugiere mecanismos de regulación específicos que aún no se entienden completamente. Muchas de las moléculas implicadas en la maquinaria fagocítica RPE han sido identificados o validado gracias a la utilización de POS aislado y ensayos de fagocitosis de cultivo celular. El receptor de la integrina alphavbeta5 situado en la superficie celular apical RPE, en coordinación con su ligando MFG-E8, se une específicamente a POS 10-12, que luego se internaliza a través del receptor quinasa de tirosina MerTK 13-15. El receptor scavenger CD36 se ha demostrado que participar en la ingesta de POS e influir en su velocidad de 16,17, y puede servir como un sensor de fosfolípidos oxidados en la superficie POS 18. Internalización necesita la contratación de F-actina del citoesqueleto-culoociated proteínas tales como la anexina 2 19, miosina II 20 y la miosina VIIA 21,22. POS o nativa oxidada in vitro también se utilizan para entender el envejecimiento de fenotipos de células del EPR en vivo vinculados a la acumulación de mal digerido POS oxidado 23-28. La generación de células del EPR derivadas de células madre ha iniciado una nueva aplicación para el aislado POS que se utilizan para probar la funcionalidad de las células antes de que se trasplantan a animales o pacientes 29,30,27. En primer lugar se describe por Molday y sus colegas en 1987 31, el protocolo para el aislamiento de POS bovina combina una etapa de ultracentrifugación de los homogeneizados de la retina en gradientes de sacarosa continuas con la observación del aspecto de color naranja característico de fotopigmento retinal crudos (llevar 11- cis retinal). En los últimos 10 años, debido a las precauciones tomadas para minimizar el riesgo de la enfermedad de las vacas locas, el uso de ojos porcinos se ha convertido en increasingly prominente. El protocolo descrito aquí muestra cómo obtener grandes cantidades de POS de porcino o de los ojos de la especie bovina que se pueden alícuotas y se almacenan durante periodos prolongados de tiempo. Esto elimina la necesidad de preparar POS de los ojos de roedores, que requiere el uso de un gran número de animales por la preparación y ensayo de POS 32,33,21,22. Además, se dan detalles sobre el etiquetado POS antes de su almacenamiento utilizando moléculas fluorescentes, para cuantificar y visualizar POS de una manera simplificada y comparable para algunas aplicaciones en comparación con POS etiquetado después de que el ensayo de la fagocitosis de 32,10. Por lo tanto, estas grandes stocks permiten reproducibilidad y facilidad de uso en muchos tipos diferentes de experimentos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Specific Material/Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">2-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>gradient maker with 30-ml chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">3-mm diameter silicone tubing</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>tubing for gradient casting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small size magnetic stir bar</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>stir bar fitting the gradient maker chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">red safelight lamp</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>inactinic lamp for dissection in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Clear 25x89 cm tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>ultracentrifugation tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PP Oak Ridge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td>30-mL centrifugation tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima LE-80K&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>365668</td>
			<td>ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 32Ti swing rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>369694</td>
			<td>swing rotor for ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avanti J-26 XP</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393124</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-25.50 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>363058</td>
			<td>rotor for Avanti J-26 XP centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FITC Isomer I</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>F-1906</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Other Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">counting chamber (such as Neubauer or Malassez)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dark ice buckets with lids</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scales</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stirrer and upholding pole</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigated microcentrifuge</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37 &#176;C water bath</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">-80 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">labcoat</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Health and safety</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gloves</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sleeve protectors</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">googles</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">absorbent pads</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biohazard trash bags and bins</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm plastic dish</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile gauze sheets</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15- and 50-mL tubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Common consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">aluminum foil</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale purification of porcine or bovine photoreceptor outer segments for phagocytosis assays on retinal pigment epithelial cells

Análisis de una de las funciones vitales de las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), la fagocitosis de gastados fragmentos distales de edad de los segmentos externos de los fotorreceptores (POS) se puede realizar in vitro. Fotorreceptoras segmentos externos con pilas de discos membranosas que contienen la maquinaria fototransducción se renuevan de forma continua en la retina. POS gastados se eliminan diariamente por células del RPE. Roedor, porcino / bovino y células del RPE humanos reconocen POS de diversas especies de una manera similar. Para facilitar la realización de grandes series de experimentos con poca variabilidad, con un amplio stock de POS puede aislarse de ojos porcinos y se almacena congelado en alícuotas. Este protocolo se aprovecha de la característica de fotopigmentos que muestran un color anaranjado cuando se mantienen en la oscuridad. Bajo una luz roja tenue, retinas se recogen en un buffer de ojeras abiertas cortadas en mitades. La suspensión de células de la retina se homogeneiza, se filtró y se cargó en un gradiente de sacarosa continuo. Después centrifugation, POS se encuentran en una banda discreta en la parte superior del gradiente que tiene un color naranja característico. POS se recogen, hilar, volvieron a suspender de forma secuencial en tampones de lavado, se contaron y se dividen en partes alícuotas. POS obtenidos de esta manera se pueden utilizar para ensayos de fagocitosis y análisis de activación de la proteína, la localización o la interacción en diversos momentos después de la exposición POS. Alternativamente, POS puede marcarse con fluoróforos, e. G., FITC, antes de alícuotas para la posterior cuantificación de fluorescencia de POS de unión o inmersión. Otras posibles aplicaciones incluyen el uso de desafío POS POS modificado o combinado con condiciones de estrés para estudiar el efecto del estrés oxidativo o envejecimiento en las células RPE.

La combinación del gradiente de sacarosa lineal y la ultracentrifugación permite la separación de los diferentes componentes de la suspensión de la retina por la densidad. Células de escombros y RPE más grande de la retina pesados ​​se hunden en o cerca de la parte inferior del gradiente (Figura 2A). Encendedor POS y las células individuales más ligeros o restos de células de la retina migran como bandas separadas para llegar a la media parte superior del gradiente por el final del período...

Watch this Scientific Journal Video about Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells at JoVE.com

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

A gran escala de purificación de porcino o bovino fotorreceptor Outer Segmentos para Fagocitosis ensayos sobre células pigmento retiniano epitelial

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

large-scale-purification-porcine-or-bovine-photoreceptor-outer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K vistas.  INSERM, U968. This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.

Video: Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

Alto Rendimiento Purificación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los merozoitos Para uso en opsonizante Antibody Ensayos

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles (MPs) are one such type of vesicles, ranging in diameter from 0.1 &#956;m to 1 &#956;m, and typically shed from the plasma membrane of eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. Here we describe the generation of T lymphocyte&#8211;derived microparticles (LMPs) from apoptotic CEM T cells stimulated with actinomycin D. LMPs are isolated through a multistep differential centrifugation process and characterized using flow cytometry. This protocol also presents an in situ cell death detection method for demonstrating the proapoptotic effect of LMPs on bronchial epithelial cells derived from mouse primary respiratory bronchial tissue explants. Methods described herein provide a reproducible procedure for isolating abundant quantities of LMPs from apoptotic lymphocytes in vitro. LMPs derived in this manner can be used to evaluate the characteristics of various disease models, and for pharmacology and toxicology testing. Given that the airway epithelium offers a protective physical and functional barrier between the external environment and underlying tissue, use of bronchial tissue explants rather than immortalized epithelial cell lines provides an effective model for investigations requiring airway tract tissue.

Cell membrane&#8211;shed microparticles (MPs) are active biological vesicles that can be isolated and their pathophysiological effects investigated in various models. Here we describe a method for generating MPs derived from T lymphocytes (LMPs) and for demonstrating their proapoptotic effect on airway epithelial cells.

Generación de linfocítica micropartículas y detección de su efecto proapoptótico sobre las células epiteliales de la vía aérea

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila exterior vesículas de membrana: Aislamiento y análisis de su potencial pro-inflamatoria en los macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

Ensayo de Fagocitosis para Células Apoptóticas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to restore function of glands damaged by radiation therapies or due to pathologies associated with Sj&#246;gren's syndrome. A second goal of researchers is to define the mechanisms by which viruses replicate within glandular tissue where they can then gain access to salivary fluids important for horizontal transmission. These goals highlight the need for a robust and accessible in vitro salivary gland model that can be utilized by researchers interested in the above mentioned as well as related research areas. Here we discuss a simple protocol to isolate epithelial cells from human salivary glands and propagate them in vitro. Our protocol can be further optimized to meet the needs of individual studies. Briefly, salivary tissue is mechanically and enzymatically separated to isolate single cells or small clusters of cells. Selection for epithelial cells occurs by plating onto a basement membrane matrix in the presence of media optimized to promote epithelial cell growth. These resulting cultures can be maintained as three-dimensional clusters, termed "salispheres", or grown as a monolayer on treated plastic tissue culture dishes. This protocol results in the outgrowth of a heterogenous population of mainly epithelial cells that can be propagated for 5-8 passages (15-20 population doublings) before undergoing cellular senescence.

We present a method for isolating and cultivating primary human salivary gland-derived epithelial cells. These cells exhibit gene expression patterns consistent with them being of salivary epithelial origin and can be grown as salispheres on basement membrane matrices derived from Engelbreth-Holm-Swarm tumor cells or as monolayers on treated culture dishes.

Aislamiento de células epiteliales salivales de glándulas salivales humanas para el crecimiento in vitro como salisferas o monocapas

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...