Obtención de imágenes de ATG9A, una proteína de membrana de expansión múltiple

En nuestro laboratorio, estamos interesados en comprender qué máquinas de lípidos y proteínas están involucradas en el tráfico de vesículas ATG9A. ATG9A es crucial en la vía de autofagia para la formación y maduración de fagóforos. Sin embargo, recientemente hemos estado estudiando el impacto de ATG9A en la homeostasis de los orgánulos.

El mayor desafío es descubrir los detalles moleculares de cómo funcionan las proteínas y las maquinarias de proteínas. Tecnologías como la ingeniería de proteínas, basada en AlphaFold y la crio-EM in situ de alta resolución, son las que más avances están proporcionando en la actualidad. El trabajo de mi laboratorio ha establecido una visión fundamental de cómo se forman los autofagosomas.

Estos conocimientos han sido respaldados por técnicas avanzadas de biología celular molecular como la que se describe aquí. Describimos algunos inconvenientes del uso de ciertas etiquetas de proteínas y cómo el comportamiento de ATG9A puede cambiar dependiendo de la localización de la etiqueta. Por lo tanto, ya sea N o C-terminal.

También sugerimos formas de detectar estos inconvenientes y cómo evitarlos. Además de esto, también proporcionamos un flujo de trabajo para cuantificar la dispersión de ATG9A de manera reproducible. Aquí, proporcionamos un flujo de trabajo desde la inmunofluorescencia y las imágenes en vivo hasta la adquisición y el análisis de imágenes para el análisis de la dispersión de ATG9 entre diferentes compartimentos celulares.

Y creemos que la estandarización de los canales para el análisis de imágenes es una prioridad para que los biólogos celulares puedan aumentar la fiabilidad y la reproducibilidad de nuestros resultados.