We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

1. Generación y Validación de quimeras de proteína fluorescente <ol><li> Anexar la proteína verde fluorescente (GFP) al extremo amino o carboxilo de la proteína de interés el uso de estrategias de DNA recombinante estándar 13. NOTA: Aunque hemos utilizado ampliamente GFP, otras variantes tales como la proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente amarilla (YFP), DsRed y mCherry se pueden emplear. Las mejoras en la eficiencia fluoróforo plegable, brillo y fotoestabilidad constantemente se están haciendo, y los investigadores deben hacer uso de las construcciones de última generación. <ol><li> Confirmar secuencia de ADN correcta y asegurar que el resto de GFP es en marco con la proteína de interés. Realizar secuenciación utilizando estrategias de ADN recombinante estándar 21. NOTA: Muchas instituciones cuentan con instalaciones de ADN del núcleo, lo que se recomienda al investigador en contacto para obtener información adicional. </li><li> Para las proteínas de membrana individuales o dobles pase, generarambas versiones de terminales amino y carboxilo de las proteínas de fusión 19. </li><li> Para las proteínas multi-GFP que abarca insertar dentro de bucles extramembrane putativo, así como los extremos. Tenga especial cuidado al generar quimeras transmembrana con la proteína de fusión fluorescente unido al extremo amino terminal de la proteína diana como las secuencias señal se escinden a menudo por proteolisis una vez que la proteína ha pasado a través de la translocon ER. </li><li> En el caso de secuencias de señal existentes, inserte el fluorescente proteína de fusión distal al sitio de escisión para generar una proteína madura que contiene una proteína fluorescente etiquetada amino-terminal intacto. Emplear estrategias estándar de ADN recombinante para la generación de quimeras 21. </li></ol></li><li> Determinar la presencia de la señal fluorescente debidamente localizado suficiente en la línea celular de interés. <ol><li> Observar las células bajo microscopio de epifluorescencia usando la fluorescencia intrínseca de GFP bajo appropricomió filtro establecer condiciones. Para los conjuntos de filtros de GFP que abarcan 510-560 nm, confirman que los filtros correctos se utilizan para el fluoróforo empleado. NOTA: Se consigue una señal suficiente cuando la evaluación por el ojo proporciona una señal suficientemente fuerte que la estructura celular en el que reside la señal se resuelve fácilmente por encima del fondo. Además, el patrón de tinción de la proteína GFP debe ser coherente con la de marcadores para el organelo apropiado, y preferiblemente idéntica a la de la proteína nativa sin etiquetar. </li></ol></li><li> Determinar si un enfoque de transfección estable o transitoria se utilizará basa en que se evalúa la proteína. NOTA: Los transfectantes estables generalmente ofrecen los niveles más bajos de expresión de los sistemas transitorios. Aunque la expresión transitoria proporciona la expresión de alto nivel de proteínas y la intensidad de aumento de la señal (~ 5-24 hr después de la transfección dependiendo de la proteína), también puede dar lugar a artefactos tales como la sobreexpresión de la proteína Aggrdele- o la saturación de las vías de la proteína diana, dando lugar a la localización subcelular errónea. </li></ol> 2. La transfección de células y cultivo celular NOTA: Una variedad de células son susceptibles de análisis FPP, incluyendo HEK293, HeLa, COS-7 y las células CHO 14. La siguiente descripción se basa en la expresión de proteínas de membrana en células HEK293. <ol><li> Cultivar células de riñón embrionario humano (Hek293) como monocapas adherentes en 6 ml de Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), 1% de piruvato de sodio y 250 g / ml de penicilina / estreptomicina a 37 ° C con 5% de CO 2. Realizar todos los trabajos con células en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar. Se cultivan las células en medio de cultivo hasta ~ 80% de confluencia en un matraz T-75. </li><li> Transfectar células utilizando cualquiera de alta eficiencia estándar, método de transfección de baja toxicidad, incluyendo lípidos, tecnologías viral- o basadas en la electroporación para generar transient o expresión estable. Normalmente 2 g de ADN plásmido por 1 x 10 6 células da buena expresión de la proteína reproducible. Mantener las células de 5-48 horas en medio de cultivo tisular apropiado a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos capaz CO 2. </li><li> Supervisar las células para la expresión de la proteína GFP-fusión mediante microscopía de epifluorescencia, utilizando la señal de fluorescencia intrínseca de GFP, usando conjuntos de filtros apropiados de acuerdo con el protocolo del fabricante. La señal de fluorescencia generalmente alcanza un máximo dentro de 24 a 72 horas después de la transfección. Utilice células cuando la señal de fluorescencia alcanza un nivel máximo. Monitorear los niveles de expresión de proteínas por el análisis de inmunoblot utilizando anticuerpos dirigidos contra la proteína de interés o el resto de GFP. </li><li> Para experimentales células de la placa de análisis sobre cubreobjetos recubiertos. Ver sea bajo una configuración de célula viva o después de la fijación y montaje en portaobjetos de microscopía. Células de la placa para alcanzar el 60% y el 80% de confluencia entre las 24-48 horas. <ol><li> Cubreobjetos capa con solución de poli-lisina (0,1 mg / ml), de modo que toda la superficie está cubierta. Incubar durante 30 min bajo una luz ultravioleta a temperatura ambiente, seguido de 60 min en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C. Retire el exceso de poli-lisina y enjuague los cubreobjetos en PBS 3 veces. </li><li> Alternativamente, la placa de las células en un cubreobjetos cámaras que consiste en placas de cultivo celular con un fondo de cristal óptico para permitir que la imagen directa con los objetivos de inmersión en aceite. La configuración real microscopía depende del equipo disponible para el investigador, pero debe ser capaz de cambios rápida solución. Dependiendo del tipo celular y celular de la forma, las células deben estar alrededor de 60-90% de confluencia en el momento del ensayo FPP. </li></ol></li></ol> 3. Configuración de microscopía de fluorescencia <ol><li> Utilice un alto objetivo de inmersión en aceite apertura numérica (NA) para la recogida de señal máxima y la resolución espacial, tal como un 60X, 1,42 NA objetivo de inmersión en aceite. Utilice ªe siguiente lasers para estimular los fluoróforos: de gas argón de 488 nm (GFP y YFP) y 561 de diodos (RFP, mCherry). </li><li> Determinar la tasa óptima exposición, la ganancia y la captura de imágenes para cada construcción. Ajusta la intensidad del láser y el tiempo de exposición para minimizar photobleaching (véase el paso 7.1.2). </li><li> Para los estudios que utilizan múltiples fluoróforos (por ejemplo, un marcador soluble para la permeabilización de la membrana en concierto con una proteína marcadora de membrana), elija filtro apropiado establece para minimizar la señal diafonía y maximizar la relación señal-ruido. </li></ol> 4. El establecimiento de condiciones óptimas para la membrana plasmática Permeabilización <ol><li> Retire el medio de cultivo celular a partir de células que expresan sólo las proteínas fluorescentes solubles (por ejemplo, EGFP, DsRed). Lavar las células 3 veces (1 min cada uno) en tampón de KHM (acetato de potasio 110 mM, 3 mM MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Realizar experimentos con células y todos los reactivos a temperatura ambiente. </li><li> Coloque las células on cubreobjetos (véase el paso 2.4) en tampón de KHM en una platina del microscopio de fluorescencia y recoger la primera imagen, que representa el control de fase &#39;no permeabilizadas&#39;. </li><li> Para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática, añadir digitonina (30 mM) en tampón de KHM a las células. Perfundir células con tampón (tampón de digitonina +) a una velocidad de 5 ml / min durante 10-60 seg. </li><li> Determinar la concentración óptima de digitonina aumentando gradualmente la concentración de digitonina. La concentración de digitonina óptima se logra cuando hay una pérdida completa de señal de fluorescencia de EGFP soluble dentro de 10-60 seg de aplicación digitonina. Para muchas células aplicación de 10-50 mu M de digitonina es suficiente para permeabilizar la membrana celular. <ol><li> Para todas las aplicaciones utilizan la concentración más baja posible de digitonina. Recoge imágenes después digitonin permeabilización de la señal de fondo permeabilizada. </li></ol></li><li> Confirme que la quimera de la proteína GFP de interés es la membrana entegrated mediante la confirmación de retención celular de la señal de fluorescencia después de la permeabilización de digitonina de la membrana plasmática 16. <ol><li> Expresar una proteína fluorescente orgánulo específico 23. Las proteínas mitocondriales funcionan bien en este sentido 16, por ejemplo, pDsRed2-Mito vector. Determinar las condiciones óptimas de expresión tal como se describe en el paso 2.1. </li><li> Confirmar que la concentración de digitonina es apropiado para el tipo de célula empleada por asegurar que la morfología de los orgánulos intracelulares permanece constante a lo largo prolongado (hasta 60 min) la exposición a la digitonina. NOTA: Use protocolos de microscopía de inmunofluorescencia estándar utilizando anticuerpos contra diversos compartimentos celulares, tales como los lisosomas (por ejemplo, LÁMPARA1), de Golgi (por ejemplo, TGN38), retículo endoplásmico (por ejemplo, calnexina), endosomas (por ejemplo, Rab5), mitocondrias (por ejemplo, el citocromo c). Si orgánulos intracelulares cambios morfología / integridad dramáticamente over 60 min, es probable que la concentración de digitonina era demasiado alto, y requiere una reducción en la concentración de digitonina y / o tiempo de exposición. NOTA: Digitonina es tóxico por inhalación y por contacto con la piel. Llevar equipo de protección personal (EPP) apropiado. </li></ol></li></ol> 5. Proteasa Tratamiento de proteínas fluorescentes <ol><li> Lavar las células en tampón de KHM y luego añadir la proteasa (proteinasa K; 50 mg / ml en tampón KHM) directamente sobre las células. Perfundir células a una velocidad de flujo de 5 ml / min usando un sistema de perfusión por gravedad a Bath continuamente la preparación. <ol><li> Soluciones de las tiendas en 50 ml jeringas y tubos de polietileno conectados reservorios independientes a un colector con una sola salida en el baño (tasa de flujo de 5 ml / min). Coloque una pipeta de succión para mantener una (0,5 ml) volumen de baño constante y lograr el intercambio de solución al cambiar manualmente entre reservorios de perfusión. </li></ol></li><li> Recoger las imágenes para determinar si el fluorseñal escent persiste o se degrada. Una pérdida de&gt; 90% de la intensidad de la señal inicial de más de 30-60 segundos es consistente con la degradación proteolítica de la quimera de la proteína GFP (ver resultados representativos). </li><li> Si no hay degradación de la señal se observa con proteinasa K, cuando se prevé dicha pérdida, reemplace la solución de proteinasa K con tripsina (4-8 mM) en tampón KHM. Si es necesario, utilizar una mezcla de proteinasa K y tripsina. No hay necesidad de apagar la actividad de la proteasa. </li></ol> 6. Enfoque alternativo para la Membrana Plasmática Proteínas con dominios externos <ol><li> Para las proteínas de la membrana plasmática, lleve a cabo el ensayo de proteínas fluorescentes externos quimeras antes de digitonin permeabilización. Lavar las células sobre cubreobjetos en tampón KHM (5 ml / min x 3 min), y tomar una imagen para el tratamiento pre-proteasa y cuantificar la señal de fluorescencia pre-proteasa que en el paso 7. </li><li> Exponer las células de la proteasa (proteinasa K; 50 mg / ml o tripsina 4-8 mM en tampón KHM) en tque ausencia de digitonina por perfusión de las células con KHM medios que contienen proteasa (velocidad de flujo 5 ml / min). Recoge imágenes de la proteína fluorescente, para determinar la rapidez con la señal desaparece o cuánto tiempo la señal persiste. </li><li> Antes de permeabilización digitonina, apagar toda la actividad de la proteasa, por lavado de las células tres veces (1 min cada uno) en medios de cultivo celular que contiene 10% de suero (FBS). </li><li> Lavar las células por perfusión con tampón de KHM (velocidad de flujo de 5 ml / min) durante 2 min. Adquirir una imagen pre-permeabilización. Permeabilizar la membrana celular como se describe en el paso 4. </li><li> Recoge imágenes después de la adición de la proteasa como se describe en el Paso 5. </li></ol> Análisis 7. Imagen <ol><li> Utilice un microscopio invertido capaz de &quot;células vivas&quot; de grabación, en el que la pérdida de la señal de fluorescencia se puede monitorizar en tiempo real. Para el monitoreo continuo, emplear parámetros idénticos (tiempo de exposición, la ganancia, la intensidad del láser, etc.). <ol><li> Determinar experparámetros imental mediante la observación de la señal de fluorescencia de la proteína GFP de interés en condiciones de control (es decir, KBH tampón solo). Ajuste los ajustes de tiempo de ganancia, la intensidad del láser y la exposición en el microscopio dirigido por ordenador para asegurar que no hay pérdida apreciable de intensidad de la señal durante un período de 10-20 min. NOTA: La intensidad de la señal no es un valor absoluto, sino que se basa en el sistema de microscopio y los ajustes disponibles para cada IP. Monitorear cambios en la intensidad de fluorescencia relativa. </li></ol></li><li> Por otra parte, el tratamiento de las células en el conjunto de los puntos de tiempo en digitonin seguido de proteasa, y fijar las células antes de montar en cubreobjetos para imágenes. Determinar empíricamente puntos de tiempo después de procedimientos en los pasos 4 y 5. Para la investigación inicial, comienzan en 0, 30, 60, 120 y 300 de post seg adición de digitonin o proteasa. <ol><li> Fijar las células (20 min a temperatura ambiente) utilizando una cantidad suficiente de fijador (3,7% de paraformaldehído en PBS) para sumergir completamente ésimocélulas e. </li><li> Se inactiva paraformaldehído residual mediante lavado las células con PBS que contenía glicina 20 mM (3 x 5 min). </li><li> Mount cubreobjetos de eliminar el exceso de líquido de la cubreobjetos e invirtiendo el cubreobjetos sobre soporte de montaje 50 l en un portas para la imagen. Deje que se sequen durante la noche antes de exponer. </li></ol></li><li> Recoger imágenes de microscopía de fluorescencia (bajo los filtros apropiados establece compatible con el fluoróforo se utiliza) mediante el uso de la función de captura de imagen de vídeo en un microscopio de fluorescencia controlado por ordenador. </li><li> Cuantificar las intensidades de señal fluorescente como una función de la condición de incubación. Obtener la intensidad media de píxeles dentro de una región de interés (ROI) que encierra una celda individual. </li></ol>

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The authors declare no conflict of interest.

La orientación correcta y la topología de proteínas de membrana es esencial para su correcto funcionamiento. A pesar de la importancia de comprender la topología de proteínas de membrana, hay muchas proteínas para los que dichos datos se carece por completo. FPP proporciona una manera fácil y eficiente de la determinación de la topología de proteínas de membrana, y uno que puede ser realizado por la mayoría de los laboratorios. El enfoque FPP ofrece ventajas significativas sobre los métodos anteriores para l...

Las membranas de plasma, así como las numerosas membranas intracelulares, sirven como barreras que separan dos compartimentos acuosos. En el caso de la membrana plasmática, la separación es entre el exterior y el interior de la célula; para orgánulos intracelulares es entre el citoplasma y el lumen de orgánulos. Por ejemplo, la membrana del retículo endoplasmático (ER) separa un ambiente oxidante dentro del lumen del ER a partir de un ambiente reductor 1 citosólica. Las proteínas de membrana son sintetizadas en los ribosomas ER-asociados, y lograr su topología final dentro de la membrana del RE 2. La adquisición de la orientación de la membrana apropiado y la topología de proteínas es crítica para su función normal. Topología correcta permite dominios correspondientes de proteínas de membrana para interactuar con sus parejas de unión, permite modificaciones post-traduccionales críticos que se produzcan, y en el caso de proteínas de membrana de plasma, permite a la célula para interactuar con y responder to su entorno. Para apreciar completamente la función de una proteína de la membrana, es claramente imprescindible saber que la proteína está orientado con respecto a la membrana dentro de la cual reside, es decir, su topología de la membrana. Además de la adquisición de conocimiento científico básico, la comprensión de la topología de una proteína de la membrana y qué aspectos de una proteína de superficie están expuestos a diferentes ambientes ha marcado implicaciones clínicas ya que las proteínas de membrana constituyen la mayoría de dianas farmacológicas 3. Hasta hace poco, los enfoques para la determinación de la topología de la proteína de membrana han requerido una inversión considerable en tiempo y dinero o han requerido reactivos que son difíciles de conseguir. Ambos enfoques experimentales y en silico se han empleado para determinar la topología de la membrana de las proteínas que residen dentro de la membrana plasmática. Desde las primeras predicciones de dominios de membrana que abarca basadas en la hidrofobicidad evaluado de indiviaminoácidos dobles 3, numerosos algoritmos predictivos ya están disponibles en el Internet, y simplemente requieren el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, los supuestos son a menudo el centro de este tipo de programas de modelado, los supuestos que pueden conducir a las asignaciones incorrectas de topología 4,5. Además, aunque estas predicciones basadas en la informática pueden asignar provisionalmente regiones que abarcan la membrana, que no siempre determinan si el amino o carboxi de las proteínas están en el citoplasma, orgánulos o lumen exterior de la célula. Incluso con el aumento de potencia de cálculo, y el uso de algoritmos de aprendizaje 6, esos datos sigue siendo un modelo, y debe ser validado a partir de datos experimentales adquiridos. Determinación experimental directa de topología de la membrana se ha realizado usando paneles de anticuerpos monoclonales con epítopos conocidos distribuidas a lo largo de la proteína, donde se ha hecho la evaluación de su inmunorreactividad antes y después de la permeabilización celular. Esteenfoque requiere un conjunto de anticuerpos, que pueden no estar disponibles para la proteína de interés. Una estrategia alternativa es diseñar epítopo etiquetas tales como myc o hemaglutinina (HA) en distintos lugares de la proteína, de nuevo seguido por la determinación de la inmunorreactividad antes y después de permeabilización de la membrana. Además de las etiquetas inmunogénicas, etiquetas enzimáticas (incluyendo la fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, o β-lactamasa) y modificaciones químicas como el escaneo cisteína han sido empleados para determinar la proteína de membrana topología 7,8. Un método adicional empleado para el mapeo topológica de proteínas de membrana de plasma se basa en un enfoque ligeramente diferente a etiquetas de epítopo. En este método, la secuencia de etiqueta es la secuencia consenso de glicosilación ligada a N NXS / T. Puesto que la glicosilación sólo se produce cuando tal secuencia está presente en el lumen de la vía de biosíntesis, la presencia de la etiqueta en un luminal frenteun compartimento citosólico se observa fácilmente como un cambio masivo en geles de SDS-PAGE. Este enfoque ha sido aplicado al canal CFTR 9 ion multispanning. Aunque se han utilizado todos estos enfoques, es claro que todos ellos requieren inversiones considerables en la biología molecular y la secuencia para generar los constructos múltiples. Para determinar la información topológica con respecto a las proteínas transmembrana localizados dentro de los orgánulos intracelulares ha demostrado ser más difícil. La aplicación de tecnologías basadas en fluorescencia sin embargo, ha hecho que la determinación de la topología de la membrana mucho más simple. La técnica de la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) se basa en la interacción entre dos fragmentos no fluorescentes de una proteína fluorescente, la restauración de las propiedades fluorescentes de que la proteína de 10. Aunque se ha descrito inicialmente para la determinación de las interacciones proteína-proteína in vivo 10, este enfoque también se ha utilizadopara determinar la topología de la proteína de membrana en células de plantas 11. Sin embargo, este enfoque también es intensiva en tiempo, ya que requiere la generación no sólo de proteínas de fusión con la proteína de interés, sino también una variedad de proteínas de fusión dirigidas al citosol u orgánulo lumen, y requiere el conocimiento de que intracelular membranas de la proteína de interés reside en . Un enfoque alternativo más sencillo para determinar la topología de proteínas de membrana se ha descrito 12. El ensayo, la fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP) requiere la generación de una proteína de fusión entre GFP y el gen de interés. El enfoque se basa en la accesibilidad relativa de las proteasas no específicas a la fracción GFP; dependiendo de si GFP está protegido de proteólisis por residente en el lumen de los orgánulos intracelulares o se expone a la proteolisis por estar presente en el citosol. Por lo tanto, si el resto GFP en la proteína de interés se enfrenta el citoplasma, que estará expuesto aactividad de la proteasa y la señal de fluorescencia pierden. Por el contrario, si el resto GFP en la proteína de interés se enfrenta a un entorno &quot;protegido&quot; de la proteasa (como el lumen de Golgi), entonces persistirá la señal de fluorescencia. Para permitir proteasas para entrar en la célula, pero no entrar en compartimentos intracelulares de membrana se utiliza el digitonina drogas unión colesterol. El colesterol es el esterol dominante en los vertebrados, y se enriqueció específicamente en la membrana plasmática con respecto a los compartimentos intracelulares. La toxina glicósido, digitonina, se extrae de la Digitalis purpurea planta. Digitonina tiene una afinidad por las membranas ricas de colesterol, donde se lleva a membrana selectiva permeabiliztion 14,16 (Figura 1). Además de permitir la salida de pequeños componentes citosólicos, digitonina permeabilización también permite la entrada de moléculas exógenas, tales como proteinasa K o tripsina. El protocolo FPP se aprovecha de la fact que la membrana plasmática contiene hasta 80% de colesterol celular 17, mientras que otros orgánulos, tales como ER, Golgi, endosomas, las mitocondrias, que tienen muy bajo contenido de colesterol, 14 permanecen intactos. La incorporación selectiva de colesterol en la membrana plasmática se ha observado en muchas células eucariotas, permitiendo el uso de la membrana plasmática de permeabilización digitonina-dependiente en diversas especies eucariotas tales como S. cerevisiae a humano 14,18. El ensayo FPP proporciona un medio simple, rápido y bastante robustas de determinar (a) si una proteína es unida a la membrana / asociado o libremente difusible en el citosol y (b) qué dominio de una proteína de membrana se enfrenta el citosol o de orgánulos lumen. En caso de una proteína de membrana tienen múltiples orientaciones, la señal será surgir de la forma dominante y formas menores no será detectado. Si bien puede haber cierta preocupación de que la adición de un resto de GFP a la proteína de interés puede afectar a su función y/ O localización subcelular, esto es en realidad más teórico que real. De hecho, muchos estudios han demostrado claramente que la etiqueta de las buenas prácticas agrarias no altera las propiedades de la proteína 19,20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="370">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:111px;">Name</td>
			<td style="width:80px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cav1-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td align="right">44433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAcGFP-1 Golgi</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">632464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polylysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mounting Media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>cS704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Membrana plasmática Permeabilización Efficient permeabilización de la membrana de plasma se determina por el uso de proteínas fluorescentes solubles (por ejemplo, GFP, DsRed) (paso 4). Estas proteínas, cuando se expresa en las células, son libres para difundir en el citosol, y se pierden cuando la membrana plasmática se permeabilizan utilizando digitonina (Figura 2). Una desaparición completa de la señal fluorescente debe ocurrir dentro de 10 a 60 ...

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Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

La determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.6K vistas.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

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Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

El uso del kit de la proteasa detección fluorescente para determinar la actividad de la proteasa

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Investigación

Biología

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter lipid bilayer properties. This is important because membrane proteins are energetically coupled to their host bilayer by hydrophobic interactions. Changes in bilayer properties thus alter membrane protein function, which provides an indirect way for amphiphiles to modulate protein function and a possible mechanism for "off-target" drug effects. We have previously developed an electrophysiological assay for detecting changes in lipid bilayer properties using linear gramicidin channels as probes 3,12. Gramicidin channels are mini-proteins formed by the transbilayer dimerization of two non-conducting subunits. They are sensitive to changes in their membrane environment, which makes them powerful probes for monitoring changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins. We now demonstrate a fluorescence assay for detecting changes in bilayer properties using the same channels as probes. The assay is based on measuring the time-course of fluorescence quenching from fluorophore-loaded large unilamellar vesicles due to the entry of a quencher through the gramicidin channels. We use the fluorescence indicator/quencher pair 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS)/Tl+ that has been successfully used in other fluorescence quenching assays 5,13. Tl+ permeates the lipid bilayer slowly 8 but passes readily through conducting gramicidin channels 1,14. The method is scalable and suitable for both mechanistic studies and high-throughput screening of small molecules for bilayer-perturbing, and potential "off-target", effects. We find that results using this method are in good agreement with previous electrophysiological results 12.

We introduce a fast fluorescence-based assay that monitors the rate of fluorescence quenching as a measure of gramicidin channel activity. The gramicidin channels are used as molecular force transducers to monitor changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins.

Gramicidina basado en ensayo de fluorescencia, para la determinación de moléculas pequeñas posibles para modificar las propiedades bicapa lipídica

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.