Este trabajo fue apoyado por el CIRM Temprana Premio de Investigación Traslacional II TR2-01821, NIH / NIDCR (subvenciones R21 DE0177711 y DE01607 SR1), UC Discovery Grant 07-10677, AWJ y RKS tienen T32 becas becas de capacitación (5T32DE007296-14), JNZ tiene una beca de formación CIRM (TG2-01169).

1. Stem Cell perivascular aislamiento Esto se describe en detalles en el artículo adyacente &quot;La purificación de las células madre de tejido humano perivasculares adiposo blanco&quot;, por M. Corselli et al. 2. Andamio Creación <ol><li> Los andamios están hechos a medida de acuerdo al protocolo previamente publicado a partir de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA, Burmingham polímero) con recubrimiento de hidroxiapatita 4-6. Apatito recubiertos andamios PLGA se fabrican a partir de 85/15 PLGA por moldeo con disolvente y un proceso de lixiviación de partículas. Los andamios se crean en una forma esférica (2-mm de diámetro) para la implantación músculo bolsa, una forma discoidal (4 mm de diámetro) para la implantación calota, o cilíndricas (4 mm de diámetro, 6 mm de longitud) para femorales defectos segmentarios. </li><li> En pocas palabras, PLGA / cloroformo soluciones mezclada con sacarosa (polímero / proporción de sacarosa 5/95, w / w), se han puesto en un diámetro de 200 a 300 micras-molde de teflón para crear los contras a la medidatruct. Tras la liofilización, durante la noche, los andamios se retira del molde de teflón y se sumergió en ddH 2 O para disolver la sacarosa. Los andamios son desinfectadas por inmersión en etanol al 70% durante 30 minutos, seguido de tres lavados de ddH 2 O. </li><li> Para el revestimiento de la apatita, un cuerpo simulado una solución líquida (SBF) se prepara disolviendo de forma secuencial CaCl2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3 y K 2 HPO 4 • 3H 2 O en ddH 2 O. PH de la solución se reduce a 6 por adición de ácido clorhídrico 1M para aumentar la solubilidad. Na 2 SO 4, KCl, NaCl y se añaden y el pH final se ajustó a 6,5 (SBF 1). </li><li> Mg2 + y HCO 3 - libre SBF (SBF 2) se prepara mediante la adición de CaCl 2 y K 2 HPO 4 • 3H 2 O en ddH 2 O y el pH se reduce a 6. KCl y NaCl se añaden y el pH final se ajustó a 6,8. Todas las soluciones son estériles filtró a través de un membr micras 0,22 PSAAne (Nalgene). Inmediatamente antes del proceso de recubrimiento, las secas andamios PLGA se someten a descarga luminiscente de plasma de argón grabado (Harrick Scientific) para mejorar la humectación y la uniformidad de recubrimiento. </li><li> Andamios Etched se incuban en SBF 1 durante 12 horas y cambió a Mg2 + y HCO 3 - libre SBF 2 para otra h 12 a 37 ° C bajo agitación suave. Andamios recubiertas se lavan con ddH 2 O para eliminar el exceso de iones y se liofilizó antes de estudios adicionales. </li></ol> 3. La bolsa muscular modelo de implantación <ol><li> 100 l de una suspensión PSC en PBS (tampón fosfato salino) son suavemente dejó caer en el esférico PLGA basada implante inmediatamente antes de la implantación. Las células han sido pre-etiquetados por inserción lentiviral de luciferasa de luciérnaga, que permitan la implantación posterior en vivo de seguimiento. La densidad celular es de 2,5 x 10 5 por implante. </li><li> SCID (inmunodeficiencia combinada severa) los ratones se utilizan a las 6 semanas de edad. Los animales son anestesiathetized por inhalación isoflurano y premedicados con buprenorfina (Laboratorios Bedford). Después de la preparación de Betadine estándar, incisiones bilaterales en las patas traseras están hechas (longitudinal y 2 mm de longitud). </li><li> Los bolsillos están cortados en los músculos bíceps femoral mediante disección roma en paralelo al eje de la fibra muscular de largo. Para cada ratón, el implante de PLGA-basado con PSC se inserta, y la fascia que recubre el músculo se sutura con Vicryl 5-0 (Ethicon). </li><li> La piel está próxima cerrado con 5-0 Vicryl en un patrón subcuticular. Los animales son tratados con buprenorfina después de la operación durante 48 horas y TMP / SMX (TMP / SMX; Qualitest) durante 10 días. </li></ol> 4. El defecto del calvario de implantación del modelo <ol><li> Después de la anestesia con isoflurano de ratones SCID (12-14 semanas de edad), el pelo se recorta y la piel desinfectada con betadine por protocolo. </li><li> Una incisión en la piel 8-mm está hecho a lo largo de la sutura sagital medio de la bóveda craneal del ratón. A continuación, el CALVarial periostio se quita suavemente por Q-tip aplicación. </li><li> A continuación, utilizando adiamantadas bits de trepanación en un taladro dental de alta velocidad, un defecto parietal 4-mm hueso se crea. El defecto es de espesor total - sin embargo se tiene cuidado de no lesionar la duramadre subyacente. </li><li> El producto a medida PLGA basada implante con PSC injertadas se coloca entonces suavemente en el sitio del defecto. La densidad celular es de 2,5 x 10 5 por implante. Por último, la piel se suturó con Vicryl 6-0. Los animales son tratados con buprenorfina después de la operación durante 48 horas y TMP / SMX durante 10 días. </li></ol> 5. El femoral defecto segmentario implantación de modelos <ol><li> Ratas atímicos (12-14 semanas de edad) son anestesiados bajo inhalación de isoflurano. El fémur se limpia y preparada según el protocolo estándar con betadine (Figura 1). </li><li> Se hace una incisión longitudinal de 27 a 30 mm se realiza sobre la cara anterolateral del fémur. El eje femoral está expuesto a continuación, mediante la separación de la latitud vastoeralis y los músculos bíceps femoral (Figura 2). </li><li> Para maximizar la consistencia de la regeneración ósea, el periostio que recubre el defecto femoral se elimina por completo con el segmento resecado femoral. </li><li> Una placa de polietileno (longitud, 23 mm; ancho, 4 mm, altura, 4 mm) se coloca sobre la superficie anterolateral del fémur. La placa contiene seis agujeros previamente perforados para dar cabida a los cables de 0,9 mm de diámetro de rosca de Kirschner (Zimmer). Tomando la placa como una plantilla, seis alambres de Kirschner roscados se perforan a través de la placa y ambas corticales (Figura 3). </li><li> A continuación, con una pequeña hoja de sierra oscilante (Stryker, MI), un niño de 6 mm a mediados de la diáfisis defecto se crea. Defectos segmentarios se tratan a continuación por la inserción de los implantes de PLGA basados ​​en que han sido cargados con células según el protocolo (Figura 4). </li><li> El músculo y la fascia suprayacente se cierra con suturas absorbibles Vicryl 4-0 para asegurar el implante en su lugar, y la piel se sutura. </li&gt; </ol> 6. En estudios in vivo <ol><li> Evaluaciones radiográficas se realizan en forma longitudinal por tanto alta resolución XR y de alta resolución μCT (micro tomografía computarizada) análisis. Para el análisis de μCT (Skyscan 1172F), las imágenes son escaneadas a una resolución de 19.73 m (100 kV y 100 mA fuente de radiación, utilizando un filtro de 0,5 mm de aluminio). Las imágenes se analizaron mediante DataViewer, Recon, CTAN, y programas de CTVol. </li><li> Imágenes de bioluminiscencia también se hace en forma secuencial para evaluar el injerto de células, la viabilidad, proliferación y no incluyen la migración fuera de la zona del implante. Imágenes de bioluminiscencia se realiza mediante un dispositivo de IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Salidas de luz se cuantificó usando el software Image Vida (Xenogen). Salida de luz total se registra en forma de fotones por segundo / sq cm / estereorradián. </li><li> El análisis histológico e histomorfométrico se realiza post-mortem. Tinciones de rutina empleadas incluyen tricrómico de Masson, azul de anilina, pentachrome y rojo Picrosirius. El análisis histomorfométrico se lleva a cabo fácilmente, ya sea con azul de anilina o manchas pentachrome, en el que osteoide aparece de color azul oscuro y amarillo, respectivamente. Píxeles por campo de alta potencia se calculan utilizando la herramienta Varita mágica en Adobe Photoshop. </li></ol> 7. Los resultados representativos Dado que tanto los defectos craneales y femorales son críticos de tamaño, no hay curación significativa se debe esperar sin tratamiento con factores de crecimiento exógenos o células madre. En cuanto a las maniobras quirúrgicas, la disección bolsa muscular debe ser a lo largo de planos fasciales y por lo tanto sangrado mínimo debe ser encontrado. A pesar de que el modelo de bolsa muscular se lleva a cabo bilateralmente, el ratón debe caminar con facilidad el primer día postoperatorio 1. Por el defecto craneal, hemorragia se encuentra, pero puede ser empapado con un Q-tip. El cuidado extremo debe tener cuidado de no lesionar la duramadre subyacente - ya que esto va a interferircon la curación normal. Para el modelo de FSD, se tenga cuidado de no lesionar los vasos sanguíneos grandes a fin de no causar sangrado excesivo o el nervio femoral para evitar el daño neurológico. Alambres de Kirschner se perforan con una presión suave para no dañar el hueso cortical en el proceso. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" /> Figura 1. La preparación preoperatoria de defecto segmentario femoral (FSD) en ratas atímicos. Las ratas macho (12-14 semanas de edad) son anestesiados bajo inhalación de isoflurano. El fémur se limpia y se prepara según el protocolo estándar con betadine. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" /> Figura 2. La exposición quirúrgica de defectos segmentales femoral (FSD) la creación. Se hace una incisión longitudinal de 27 a 30 mm se realiza sobre la cara anterolateral del fémur. La cara lateral de la caña femoral se expone entonces separando el vasto lateraly los músculos bíceps femoral. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" /> Figura 3. La fijación femoral de defecto segmentario (FSD) la creación. Una placa de polietileno (longitud, 23 mm; ancho, 4 mm, altura, 4 mm) se coloca sobre la superficie anterolateral del fémur. La placa contiene seis agujeros previamente perforados para dar cabida a los cables de 0,9 mm de diámetro de rosca de Kirschner. Tomando la placa como una plantilla, seis alambres de Kirschner roscados se perforan a través de la placa y cortezas ambos. A continuación, una de 6 mm a mediados de la diáfisis defecto se crea. Una vez que esto se realiza, un andamio a medida que se insertan directamente que encaja exactamente el sitio del defecto (no mostrado). <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" /> Figura 4. Ejemplo de defecto postoperatorio del calvario. A 4 mm, un defecto del calvario circular se creó en el hueso parietal derecho en ratones atímicos. Toma de imágenes de aquí es un sitio del defecto implantado conPSC a las 8 semanas postoperatorias. Tenga en cuenta la presencia de hueso nuevo en el sitio del defecto.

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KT, BP, y CS son los inventores de perivasculares de células madre relacionadas con las patentes registradas en la UCLA. Dres. KT, y CS son fundadores de cicatrices Laboratories Inc., que sublicencias perivasculares de células madre relacionadas con las patentes de los regentes de la UC. El Dr. Chia Soo ocupa también un cargo de los Laboratorios de cicatrices, Inc.

El aislamiento del PSC está bien descrito en otra parte 03.01, incluyendo una publicación por separado Jove presentó específicamente a los protocolos de aislamiento del PSC y los métodos. El propósito específico de este artículo es describir y demostrar 3 protocolos de PSC en la aplicación in vivo para la formación de hueso / regeneración. La bolsa muscular de ratón SCID es un modelo comúnmente descrito para la formación ectópica de hueso humano 7. Existen importantes diferencias entre ectópicos y ortotópico (defecto) los modelos de los huesos, incluyendo la interacción con los receptores que forman paracrina ósea las células 8, así como una gran cantidad de factores osteogénicos de señalización presentes en el microambiente del defecto óseo. Dos defectos se presentan aquí, un defect8 calota y el defecto femoral segmentaria 4. Ambos están bien documentados a ser crítico de tamaño (es decir, no se curan por sí solas). Existen diferencias interesantes entre los defectos craneales y femorales. En primer lugar, elcelular: la interacción entre las células y las células PSC xenoinjertados endógenos es muy diferente. En términos de un defecto craneal, PSC interactuar con la duramadre subyacente (la capa más externa de las meninges), así como aquellos osteoblastos y células periósticos que circunscriben el sitio del defecto. Es importante destacar que la interacción entre las células implantadas y los osteoblastos que rodean 8, o de las células implantadas y que subyace a la duramadre (Levi et al., En prensa) son fundamentales para la célula madre normal mediada la osteogénesis para continuar. En términos del defecto femoral segmentaria (FSD), PSC xenoinjertados están expuestos a una celda muy diferente y el medio ambiente de citoquinas. Por ejemplo, el sitio FSD se compone de las células madre de médula ósea y de acompañamiento mesenquimales, así como el endostio, periostio y los osteoblastos de huesos largos. En teoría, cada célula tiene su propia reacción a una lesión, y cada uno puede tener de células: las interacciones celulares con xenoinjertos PSC. Otras claras diferencias existen entre la calotay los defectos femorales. Los huesos craneales inicialmente forman a través de osificación intramembranosa, mientras que los huesos se forman largas a través de un intermedio de cartílago (osificación endocondral). Por otra parte, el proceso de reparación después de la lesión también imita estos orígenes evolutivos. Después de la FSD, la formación de cartílago de callos se observa, mientras que no intermedia del cartílago se forma dentro de un defecto de hueso parietal. Finalmente, el origen embrionario del cráneo puede diferir de la de los huesos largos. La mayoría del cráneo (incluyendo las células perivasculares - pericitos - en la región de la cabeza entera) se deriva de la cresta neural (mesectoderm), mientras que el esqueleto apendicular es de derivación mesodermo paraxial 9. Todas estas diferencias pueden resultar en diferencias significativas en cuanto a la reparación ósea mediada por PSC. El uso de la PSC tiene varias ventajas sobre los tradicionales derivadas de tejido adiposo células del estroma (ASC). PSC no requieren de la cultura y son una población de células purificadas WHIch no incluye otras células del estroma que no participan en el - e incluso se puede regular negativamente - la diferenciación osteogénica, como las células endoteliales 10. En contraste, por ejemplo, los análisis clonales de ASCs muestran que sólo una subpoblación son capaces de experimentar diferenciación osteogénica in vitro 11. En última instancia, los esfuerzos de ingeniería de tejidos esqueléticos probable que incorpore una célula madre osteocompetent (como PSC) con factores de crecimiento exógenos y un osteoconductivo andamio (tales como HA-PLGA utilizada en los presentes métodos) para curar mejor defectos óseos.

use of human perivascular stem cells for bone regeneration

Las células madre perivasculares (PSC) puede ser aislado en un número suficiente de múltiples tejidos para fines de tejido esquelético ingeniería 1-3. PSC son una población FACS-ordenados de &#39;pericitos&#39; (CD146 + CD34-CD45-) y de células adventicias (CD146-CD34 + CD45-), cada uno de los cuales ya hemos informado que tienen propiedades de las células madre mesenquimales. PSC, como MSC, son capaces de someterse a la diferenciación osteogénica, así como secretan pro-osteogénico 1,2 citoquinas. En el presente protocolo, se demuestra la osteogenicity del PSC en varios modelos animales, incluyendo un implante de bolsa muscular en SCID (inmunodeficiencia combinada severa) en ratones, un defecto del ratón SCID del calvario y un defecto femoral segmentaria (FSD) en ratas atímicos. El músculo del muslo modelo de bolsa se utiliza para evaluar la formación de hueso ectópico. Defectos de calota se centran en el hueso parietal y son de forma estándar de 4 mm de diámetro (tamaño crítico) 8. FSD son bicortical y se estabilizan conuna barra de polietileno y 4 K-cables. El FSD descrito es también un defecto de tamaño crítico, que no curan significativamente en su propio 4. Por el contrario, si las células madre o factores de crecimiento son añadidos al sitio del defecto, la regeneración ósea significativa se puede apreciar. El objetivo general de xenoinjerto PSC es demostrar la capacidad osteogénica de este tipo de células en modelos de regeneración tanto ectópicos y hueso ortotópico.

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Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Las células madre perivasculares (PSC) son una nueva clase de madre para la regeneración celular del tejido óseo similares a las células madre mesenquimales (MSC). PSC puede ser aislado por FACS (fluorescencia de células activadas clasificación) a partir de tejido adiposo adquirido durante los procedimientos estándar de liposucción, entonces se combinan con una osteoinductivo andamio para lograr la formación de hueso<em&gt; En vivo</em&gt;.

El uso de las células estaminales perivasculares para la regeneración ósea

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

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20.3K vistas.  School of Dentistry, UCLA. Las células madre perivasculares (PSC) son una nueva clase de madre para la regeneración celular del tejido óseo similares a las células madre mesenquimales (MSC). PSC puede ser aislado por FACS (fluorescencia de células activadas clasificación) a partir de tejido adiposo adquirido durante los procedimientos estándar de liposucción, entonces se combinan con una osteoinductivo andamio para lograr la formación de hueso En vivo.

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcápsulas de alginato como una plataforma 3D para la propagación y diferenciación de las células estaminales embrionarias humanas (CMEH) para los diferentes linajes

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Investigación

Bioingeniería

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

Protocolo para la transferencia de microARN en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Perfil de compatibilidad biológica de Biomateriales para regeneración ósea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Absorción de nuevas nanopartículas recubiertas de lípidos que contienen Falcarindiol por células madre mesenquimales humanas

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Patrón de la geometría de las colonias de células madre embrionarias humanas en sustratos compatibles para controlar la mecánica de nivel de tejido

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Un método de cultivo para mantener las células madre hematopoyéticas humanas quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas primarias utilizando Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...