Este protocolo permite la fabricación de análogos óseos sin necesidad de calentamiento o productos químicos tóxicos. De esta manera, las estructuras óseas se forman con el potencial de reparar un defecto óseo en entornos clínicos utilizando las propias células de un paciente. La principal ventaja de la técnica es que la tinta ósea se puede imprimir con células vivas para formar cualquier estructura ósea compleja y dirigir la diferenciación hacia el linaje de formación ósea.
Además, los medicamentos se pueden cargar en la tinta de hueso para mejorar simultáneamente la cicatrización de heridas, la regeneración ósea y para tratar patologías como el cáncer. Demostrando el procedimiento estarán Gagan Jalandhra, un candidato a doctorado en mi laboratorio, y la Dra. Sara Romanazzo, que ha trabajado conmigo y con el Dr. Jalandhra en varios proyectos, incluido el desarrollo de esta tecnología. Comience agregando la mezcla de polvo de fosfato de hidrógeno de calcio y carbonato de calcio a un crisol de zirconia de tal manera que no esté más del 75% de su capacidad.
Transfiera el crisol a un horno, caliéntelo a 1, 400 grados centígrados a una velocidad de cinco grados centígrados por minuto y manténgalo durante tres horas. Apague la reacción retirando el crisol del horno y dejándolo en una parte superior del bloque refractario. Deje que se enfríe completamente antes de manipularlo.
Use un mortero para romper y moler la torta de fosfato alfa-tricálcico de tal manera que los gránulos resultantes tengan un tamaño máximo de 200 micrómetros. Agregue tres bolas de zirconia estabilizadas con itria a la mezcla molida, seguidas de etanol al 100%. Asegure la tapa y muele durante dos horas a 180 rotaciones por minuto.
Recoger la suspensión y separar las bolas, utilizando etanol 100% para el lavado. Seque la suspensión en un horno a 120 grados centígrados durante 24 horas. Agregue el polvo seco a los frascos de molienda con bolas de zirconia de un milímetro y etanol al 100% en las mismas proporciones de peso que en la primera etapa.
Moler durante dos horas a 180 rotaciones por minuto. Luego separar y secar en el horno. Retire la muestra del horno.
Para hacer la tinta de hueso, agregue 630 microlitros de glicerol y 130 microlitros de polisorbato 80 a un frasco de bola. Luego agregue 100 miligramos de fosfato de amonio dibásico y dos gramos de polvo de fosfato alfa-tricálcico a la solución y revuelva continuamente con una espátula para combinar. Agregue una bola de zirconia de 25 milímetros, asegure la tapa y colóquela dentro de un molino planetario durante 60 minutos a 180 rotaciones por minuto, deteniéndose hasta la mitad para raspar los lados del frasco con una espátula usando una espátula.
Cargue la tinta en una jeringa de un mililitro. Haga una solución al 10% de gelatina tipo A en 1X PBS como se describe en el texto manuscrito. Colocar el matraz cónico sobre el agitador.
Luego agregue 5.796 mililitros de anhídrido metacrílico y continúe revolviendo en la oscuridad a 50 grados centígrados durante 90 minutos. Apague la reacción diluyendo el contenido de los matraces cónicos dos veces con PBS. Decantar en tubos de 50 mililitros y eliminar el anhídrido metacrílico sin reaccionar por centrifugación a 3000 RCF a temperatura ambiente durante tres minutos y recoger el sobrenadante.
Dialice el sobrenadante dentro de los tubos de diálisis de celulosa de corte de 14 kilodalton contra agua desionizada a 40 grados centígrados durante cinco días mientras agita suavemente. Reemplace el agua desionizada todos los días. Prepárese para el almacenamiento decantando en tubos de 50 mililitros, asegurando la tapa y colocándola en el refrigerador durante 12 horas.
Luego congele las muestras con nitrógeno líquido e inmediatamente liofilice durante cinco días a menos 54 grados centígrados y 0,4 milibares. Guarde la espuma resultante en un congelador a menos 20 grados centígrados. Para sintetizar microgeles GelMA, haga una solución de GelMA al 10% peso por peso en PBS pesando el GelMA liofilizado, agregándolo a un tubo con PBS y calentándolo en un baño maría a 50 grados centígrados hasta que esté completamente hidratado.
Agregue 37 mililitros de aceite por mililitro de solución GelMA a un vaso de precipitados, asegurándose de que no esté más del 65% lleno. Configure un sistema de vaso doble en una placa caliente con agitación magnética colocando el vaso de precipitados que contiene aceite dentro de un vaso de precipitados más grande. Calentar a 40 grados centígrados mientras revuelve.
Cargue la solución de GelMA en una jeringa y agréguela gota a gota en el aceite de agitación a través de un filtro de 0,45 micrómetros. Deje que la emulsión se equilibre durante 10 minutos. Reduzca la temperatura de la emulsión a 15 grados centígrados a temperatura térmica.
Estabilice las esferas agregando hielo picado en el espacio entre los dos vasos de precipitados. Agregue acetona a la emulsión GelMA giratoria. Decantar el contenido del vaso de precipitados en tubos de 50 mililitros, asegurándose de lavar las paredes del vaso de precipitados con acetona.
Deje reposar durante 20 minutos para permitir que los micro geles deshidratados se asienten en el fondo. Deseche el sobrenadante y lave los microgeles dos veces con acetona. Consolidar en un tubo, rellenar con acetona y sonicar durante 10 segundos.
Nuevamente, lávelo con acetona dos veces. Conservar en acetona a temperatura ambiente hasta que sea necesario para la impresión. Para preparar la suspensión de microgel GelMA para la impresión, formule una solución de GelMA al 1% peso por peso en DMEM como se describe en el texto manuscrito.
Evaporar la acetona de los microgeles deshidratados y pesar el polvo resultante en un tubo. Agregue acetona y transfiérala a un ambiente estéril. Para formar la suspensión de microgel, evapore la acetona del polvo dentro del gabinete de bioseguridad.
Después de la evaporación, agregue DMEM, solución de GelMA al 1% en DMEM y solución iniciadora de LAP al 2,5% para lograr una fracción de empaque final de 30%Deje hidratar completamente durante al menos 12 horas a temperatura ambiente. Cultive las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo en DMEM bajo en glucosa suplementado con 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono hasta que sean confluentes. Extraer las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo del matraz de cultivo de tejidos retirando el medio y lavando con PBS estéril.
Granular las células centrifugando a 150 RCF a temperatura ambiente durante cinco minutos. Cuente las células y calcule al menos 5 x 10 a las cinco células por cada mililitro de microgeles GelMA. Asigne el volumen requerido de la suspensión celular a un tubo y un pellet separados como se demostró anteriormente.
Retire con cuidado la mayor cantidad posible de sobrenadante con una pipeta, dejando solo la bolita celular. Agregue el volumen requerido de suspensión de microgel al pellet y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para garantizar una distribución uniforme. Cargue la suspensión de microgel cargada de células en un reactor utilizando una pipeta.
Usando una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 23, deposite la tinta de hueso, entrecruze la célula y las construcciones de microgel GelMA cargadas de tinta ósea con una lámpara de reticulación UV a 405 nanómetros durante 90 segundos. Transfiera inmediatamente la suspensión de microgel a una placa de pozo del tamaño adecuado que contenga DMEM completo. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Reemplace el medio de cultivo después de 24 horas, luego cada 48 a 72 horas según sea necesario. La tinta ósea se analizó mediante microscopía electrónica de barrido para determinar su microestructura, que mostró la formación de cristal de hidroxiapatita después del ajuste de la tinta, particularmente visible en condiciones secas. En este estudio, las células se mezclaron con microgeles GelMA y se mantuvieron en cultivo durante un máximo de cinco días, ya sea solo en suspensión de microgel o en el sistema COBICS.
Las células mostraron buena viabilidad en presencia de la tinta ósea, tanto en el día uno como en el día cinco, confirmando que los productos de lixiviación de la tinta no eran perjudiciales para las células. Es crucial controlar la velocidad de riego mientras se sintetiza microgel, ya que un ligero cambio de agitación puede causar diferencias de tamaño. También es importante asegurar una distribución homogénea de las células dentro de la suspensión de microgel.
El mismo protocolo se puede utilizar para imprimir dentro de suspensiones de microgel de gelatina, que actúan como soportes de sacrificio, dejando atrás construcciones óseas independientes. Pero el uso de GelMA abre la vía para construcciones multifásicas de una olla, como las interfaces osteocondrales o tendinosas óseas.
