Comience colocando un ratón sacrificado para la enucleación ocular usando pinzas curvas para presionar el tejido alrededor del ojo para desplazar el ojo fuera de la órbita. A continuación, levante y retire el ojo, y transfiéralo a PBS fresco en la bandeja de disección. Con unas tijeras ultrafinas, corte el nervio óptico lo más cerca posible del globo ocular e inserte con cuidado unas pinzas rectas de punta fina en el globo ocular a través de la salida del nervio óptico en la parte posterior del ojo.
Ahora, inserte unas tijeras en la parte posterior del ojo y comience a hacer una incisión desde la parte posterior hacia la unión escleral corneal, y continúe la incisión hasta que se haya separado la mitad de la unión. Empuje suavemente la córnea para que el cristalino pueda salir a través de la incisión. Con unas pinzas rectas de punta fina, retire con cuidado los trozos grandes de tejido de la lente.
Después de encontrar la región ecuatorial, perfore superficialmente la lente y luego retire la cápsula de la lente. Transfiera las celdas de fibra de la lente a un plato de 60 milímetros con 1% de paraformaldehído. Con un bisturí afilado, divida la bola de las células de la fibra por la mitad a lo largo de su eje anteroposterior.
Y luego corta aún más las mitades a lo largo del mismo eje para producir cuartos. Utilice las pinzas rectas para eliminar la región del núcleo del cuarto de la célula de la fibra del cristalino. A continuación, agregue 200 microlitros de paraformaldehído al 1% a una placa de 48 pocillos.
Transfiera la corteza del cristalino a la placa e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente agitando suavemente a 300 RPM. Después del bloqueo, agregue los anticuerpos primarios apropiados a la placa de 48 pocillos y transfiera las muestras a la solución de anticuerpos primarios. Incubar las muestras durante la noche a 4 grados centígrados con una suave agitación o mutación.
Al día siguiente, lavar las muestras con PTX y, del mismo modo, incubarlas con anticuerpos secundarios. Después de lavar las muestras, agregue una gota o 50 microlitros de medios de montaje en un portaobjetos de microscopio cargado más. Coloque el pañuelo en el medio de montaje.
Y use pinzas para separar suavemente las células de fibra entre sí. A continuación, coloque suavemente un cubreobjetos encima de las celdas separadas y los medios de montaje. Después de eliminar el exceso de medios, use esmalte de uñas para sellar los bordes de la cubierta en el portaobjetos antes de la microscopía confocal.
Después de la disección del cristalino y la extracción de la cápsula del cristalino, transfiera la masa de células de fibra a las yemas de los dedos enguantadas y enrolle suavemente en todas las direcciones para separar el núcleo del cristalino. Luego, transfiera el núcleo del cristalino a una solución de paraformaldehído al 1% recién hecha en una placa de 48 pocillos e incube durante la noche a 4 grados Celsius con una suave agitación o mutación. Al día siguiente, transfiera la muestra a una placa de 60 milímetros con paraformaldehído al 1% y use un bisturí afilado para dividir el núcleo del cristalino a lo largo del eje anteroposterior por la mitad, luego en cuartos.
A continuación, fije, bloquee, tiña y monte la muestra como se demostró anteriormente En estas preparaciones, se encuentran haces de células de fibra del cristalino con morfologías únicas de diferentes regiones del cristalino. La tinción de la red de F-actina muestra un enriquecimiento en la membrana celular en fibras diferenciadas y maduras, mientras que las señales de F-actina están presentes en el citoplasma de las fibras nucleares. La microscopía electrónica de barrido y las imágenes confocales de células de fibra diferenciadas muestran interdigitaciones de bola y alveolo con pequeñas protuberancias entrelazadas, mientras que las fibras maduras tienen paletas decoradas por pequeñas protuberancias.
Las imágenes de microscopía electrónica de barrido y microscopía confocal de las células de fibra del cristalino nuclear revelan protuberancias entrelazadas poco frecuentes y más grandes en los lados cortos de las células donde la membrana celular es rugosa y tiene interdigitaciones machihembradas en estas células desde el centro del cristalino.
