Bu çalışma, Ulusal Göz Enstitüsü'nden R01 EY032056 (CC'ye) hibesi ile desteklenmiştir. Yazarlar, elektron mikroskobu görüntülerine yardımları için Scripps Araştırma Çekirdek Mikroskopi Tesisi'nden Dr. Theresa Fassel ve Kimberly Vanderpool'a teşekkür eder.

Fareler, Indiana Üniversitesi Bloomington'daki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan bir hayvan protokolüne göre bakılmıştır. Temsili veri üretmek için kullanılan fareler, C57BL6 / J arka planında, dişi ve 8-12 haftalık kontrol (vahşi tip) hayvanlardı. Bu deney için hem erkek hem de dişi fareler kullanılabilir, çünkü farelerin cinsiyetinin deneyin sonucunu etkilemesi pek olası değildir.
1. Lens diseksiyonu ve dekapsülasyonu
<ol><li>Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu"na ve kurum tarafından onaylanan hayvan kullanım protokollerine uyarak farelere ötenazi uygulayın. NOT: Bu çalışma için, farelere CO2 doz aşımı ve ardından onaylanmış bir hayvan protokolüne (Indiana Üniversitesi) uygun olarak servikal çıkık ile ötenazi uygulandı.</li>
	<li>Gözü yuvadan çıkarmak için forsepsin bir tarafı ile göz çevresindeki dokuya bastırarak kavisli forseps kullanarak farelerden gözleri enüklee edin. Ardından, gözün altındaki forsepsleri kapatın ve gözü yuvadan çıkarmak için kaldırın. Gözleri bir diseksiyon tepsisindeki taze 1x fosfat tamponlu saline (PBS) aktarın.</li>
	<li>Optik siniri ultra ince makasla göz küresine mümkün olduğunca yakın kesin. İnce uçlu, düz cımbızları, gözün arkasındaki optik sinirin çıkışından göz küresine dikkatlice sokun.</li>
	<li>Makası adım 1.3'teki cımbızla aynı yere dikkatlice yerleştirin ve arkadan kornea-skleral bileşkeye doğru bir kesi kesmeye başlayın. NOT: Kemirgen lensler gözlerinin ~%30'unu kaplar. Cımbız veya makas gözün çok derinine sokulursa kazara hasar meydana gelir.</li>
	<li>Kavşağın en az yarısı ayrılana kadar kornea-skleral bileşke boyunca kesmeye devam edin.</li>
	<li>Merceğin 1.4 ve 1.5 adımlarla yapılan kesiden çıkabilmesi için korneayı hafifçe itmek için cımbız kullanın.</li>
	<li>İnce uçlu, düz cımbız kullanarak lensteki büyük doku parçalarını dikkatlice çıkarın. Ekvator bölgesini bulmak için lensi inceleyin.</li>
	<li>İnce uçlu, düz cımbız kullanarak lensi sığ bir şekilde delin ve ardından lens kapsülünü çıkarın. Lens fiber hücrelerinin kütlesi bozulmadan kalacak ve lens epitel tek tabakası lens kapsülüne bağlı kalacaktır. Lens kapsülünü atın.</li>
</ol>2. Lens tek fiber hücre boyama
<ol><li>Lens fiber hücre kütlesini, 500 μL taze yapılmış %1 paraformaldehit (PFA; 1x PBS'de) çözeltisi içeren bir kuyu plakasına aktarın ve numuneleri gece boyunca 4 °C'de hafif nütasyon ile inkübe edin (Şekil 2A). NOT: Verilen çözeltilerin hacimleri 48 oyuklu plakalar için optimize edilmiştir. Başka boyutta kuyu plakası veya tüpler kullanılıyorsa, çözeltilerin hacimlerini buna göre ayarlayın. Fiksasyon, blokaj ve yıkama (1x PTX, 1x PBS'de %0.1 Triton X-100) çözeltileri, 10x PBS ve çift damıtılmış su (ddH2O) ile 1x PBS'lik bir nihai konsantrasyona kadar yapıldı.</li>
	<li>Lens fiber hücrelerini %1 PFA'lı 60 mm'lik bir kaba aktarın. Fiber hücre topunu ön-arka ekseni boyunca ikiye bölmek için keskin bir neşter kullanın (Şekil 2B). Çeyrek üretmek için yarımları aynı eksen boyunca tekrar ikiye bölün. NOT: Anterior-posterior aks, doku kütlesindeki lif hücrelerinin yönü ile kolayca tanınır.</li>
	<li>Çekirdek bölgesini lens lifi hücre bölgelerinden çıkarmak için düz cımbız kullanın (Şekil 2C). NOT: Lens çekirdeği bölgesi kemirgen lenslerde serttir ve lensin merkezi daha yumuşak kortikal liflerden kolayca ayrılacaktır.</li>
	<li>Lens korteks bölgesinin dörtte birini 200 μL %1 PFA'da oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak (bir plaka çalkalayıcıda 300 rpm) sonradan sabitleyin.</li>
	<li>Doku çeyreklerini 750 μL 1x PBS'de her biri 5 dakika boyunca RT'de hafifçe çalkalayarak iki kez yıkayın.</li>
	<li>RT'de 1 saat boyunca 200 μL bloke edici solüsyon (%5 serum, %0.3 Triton X-100, 1x PBS) kullanarak numuneleri hafifçe çalkalayarak bloke edin. NOT: Bu protokoldeki temsili veriler için, numuneler birincil veya ikincil antikorlarla boyanmamıştır. Bloklama adımından sonra, numuneler buğday tohumu aglütinini (WGA; 1:100) ve falloidin (1:100) (Malzeme Tablosuna bakınız) ile RT'de 3 saat boyunca hafifçe çalkalama ve ışıktan korunma ile inkübe edildi. Primer antikor boyaması önceki yayınlardagösterilmiştir 22,23.</li>
	<li>100 μL primer antikor çözeltisi ile gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak inkübe edin. NOT: Antikorlar, bloke edici çözelti içinde seyreltilir. Doku kesitli slaytlarla karşılaştırıldığında, bu tür preparatlarda daha fazla hücre vardır. Daha fazla hücreyi boyamak için yeterli antikor sağlamak için birincil antikor konsantrasyonları arttırılmalıdır. Doku kesitlerinde kullanılandan antikor konsantrasyonunun iki katına çıkarılması önerilir. Aynısı ikincil antikorlar için de geçerlidir.</li>
	<li>Mendil çeyreklerini 1x PTX (%0.1 Triton X-100, 1x PBS) ile RT'de her biri 5 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak üç kez yıkayın.</li>
	<li>Fiber hücrelerini 100 μL ikincil antikor/boya çözeltisi ile RT'de 3 saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Bu ve sonraki adımlar sırasında numuneleri ışıktan koruyun. NOT: WGA, falloidin ve diğer floresan boyalar, hücre zarının, hücre iskeletinin veya diğer organellerin aynı anda etiketlenmesi ve aynı zamanda birincil antikorun etiketlenmesi için ikincil antikor çözeltisine eklenebilir.</li>
	<li>Fiber hücreleri, RT'de her biri 5 dakika boyunca 1x PTX ile dört kez hafifçe çalkalayarak yıkayın.</li>
	<li>Doku çeyreklerini slayda aktarmadan önce artı şarjlı bir mikroskop lamına bir damla veya 50 μL montaj ortamı ekleyin.</li>
	<li>Fiber hücrelerini birbirinden nazikçe ayırmak için cımbız kullanın ve hücre demetlerinin üst üste binmesini sınırlamaya çalışın.</li>
	<li>Montaj ortamındaki s'nin üzerine yavaşça #1.5 lamel uygulayın. Montaj ortamı, lamel kenarına yayılmalıdır; Bu olmazsa, lamel kenarına ek montaj ortamı ekleyin. Lamelin kenarındaki fazla montaj malzemelerini aspire edin ve lamel kenarlarını sürgü üzerinde kapatmak için oje kullanın. NOT: Bu deneyler için konfokal mikroskopi için formüle edilmiş her türlü montaj ortamı kullanılabilir.</li>
</ol>3. Lens çekirdeği tek lif hücre boyama
<ol><li>Bölüm 1'de özetlenen diseksiyonu tamamlayın.</li>
	<li>Fiber hücre kütlesini ıslak, eldivenli parmak uçlarına nazikçe aktararak ve doku kütlesini nazikçe yuvarlayarak kortikal lifleri lens lifi hücrelerinin topundan mekanik olarak çıkarın, lens çekirdeğini bırakın. NOT: Fare lenslerinde, lens lifi hücrelerinin topunu eldivenli parmak uçları arasında yuvarlamak, kortikal lif hücrelerinin sert lens çekirdeğinden çıkarılması için etkili bir yöntemdir28,30. Bu mekanik yöntemin etkili olmadığı lensler için, kortikal lif hücrelerini çıkarmak için dikkatli bir diseksiyon veya vorteksleme yöntemi29 kullanılabilir.</li>
	<li>Lens çekirdeğini bir kuyu plakasında yeni yapılmış %1 PFA çözeltisine aktarın ve gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak inkübe edin.</li>
	<li>Numuneyi %1 PFA içeren 60 mm'lik bir tabağa aktarın ve lens çekirdeğini ön-arka eksen boyunca bölmek için keskin bir neşter kullanın. Çekirdek çeyrekleri üretmek için doku örneklerini tekrar yarıya indirin.</li>
	<li>İmmün boyama ve numune montajı için 2.4-2.13 adımlarında özetlenen süreci izleyin.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65638/65638fig02v2.jpg"> Şekil 2: Lens fiber hücrelerinin hazırlanmasını ve immün boyamayı detaylandıran grafik özet . (A) Bu 48 oyuklu plaka, tarif edilen yöntemler için bir numune plakası kurulumunu göstermek için kolonla renk kodludur, bu da forseps kullanılarak nazik bir şekilde işlenerek numunelerin çeşitli immün boyama adımları arasında kolay transferine izin verir. Bu protokol için temsili veriler bir primer antikor ile inkübe edilmese de, diyagram primer antikor inkübasyonu için bir kolon içerir ve yıkama için kuyucuklar, kullanılmış yıkama tamponları aspirasyonla çıkarıldıktan sonra yeniden kullanılabilir. (B) Lens lifi hücre kütlesinin sabitlenmesinden sonra, hücrelerin orijinal yapısını korumak için doku ön-arka eksen (kırmızı kesikli çizgiler) boyunca bölünür. Doku kütlesi yarıya indirildikten sonra, numuneler döndürülür ve yarımlar ön-arka eksen boyunca dörde bölünür (kırmızı kesikli çizgiler). (C) Lens çekirdeği bölgesinin (pembe renkte) çıkarılması, kortikal lif hücrelerinden (mavi renkte) yoğun merkezi dokuyu çıkarmak için cımbız kullanılarak kolayca yapılır. Karikatür diyagramları kısmen BioRender.com kullanılarak oluşturuldu ve ölçeğe göre çizilmedi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65638/65638fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Lens Lifi Hücrelerinde Membran Etkileşimlerinin İmmünofloresan Boyanması

<ol>
	<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+regulation+of+lens+development.">Growth factor regulation of lens development.</a> Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).</li><li>Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface+morphology+of+embryonic+and+adult+chick+lens-fiber+cells.">The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells.</a> The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).</li><li>Kuszak, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+epithelial+and+fiber+cells+in+the+crystalline+lens.">The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens.</a> International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).</li><li>Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereo+scanning+electron+microscopy+of+the+crystalline+lens.">Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).</li><li>Lo, W. K., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Square+arrays+and+their+role+in+ridge+formation+in+human+lens+fibers.">Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers.</a> Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).</li><li>Taylor, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+the+normal+human+lens.">Morphology of the normal human lens.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 37 (7), 1396-1410 (1996).</li><li>Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+the+human+eye+lens-a+morphological+point+of+view.">Aging of the human eye lens-a morphological point of view.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).</li><li>Vrensen, G. F., Duindam, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+fiber+membranes+in+the+human+eye+lens.+Ultrastructural+and+Raman+microspectroscopic+observations.">Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations.</a> Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).</li><li>Willekens, B., Vrensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+organization+of+lens+fibers+in+the+rabbit.+A+scanning+electron+microscopic+reinvestigation.">The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation.</a> Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).</li><li>Willekens, B., Vrensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+organization+of+lens+fibers+in+the+rhesus+monkey.">The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).</li><li>Zhou, C. J., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+clathrin,+AP-2+adaptor+and+actin+cytoskeleton+with+developing+interlocking+membrane+domains+of+lens+fibre+cells.">Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells.</a> Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).</li><li>Kuwabara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maturation+of+the+lens+cell:+a+morphologic+study.">The maturation of the lens cell: a morphologic study.</a> Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).</li><li>Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness+gradient+in+the+crystalline+lens.">Stiffness gradient in the crystalline lens.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (9), 1357-1366 (2007).</li><li>Weeber, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+properties+of+human+lenses.">Dynamic mechanical properties of human lenses.</a> Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).</li><li>Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relationship+between+lens+stiffness+and+accommodative+amplitude.">On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude.</a> Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).</li><li>Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+increase+in+the+stiffness+of+the+human+lens+nucleus+with+age:+the+basis+for+presbyopia.">Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia.</a> Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).</li><li>Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presbyopia+and+heat:+changes+associated+with+aging+of+the+human+lens+suggest+a+functional+role+for+the+small+heat+shock+protein,+alpha-crystallin,+in+maintaining+lens+flexibility.">Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility.</a> Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).</li><li>Glasser, A., Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biometric,+optical+and+physical+changes+in+the+isolated+human+crystalline+lens+with+age+in+relation+to+presbyopia.">Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia.</a> Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).</li><li>Pierscionek, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+response+of+human+lenses+to+stretching+forces.">Age-related response of human lenses to stretching forces.</a> Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).</li><li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens.">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li><li>Lo, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-0+targets+interlocking+domains+to+control+the+integrity+and+transparency+of+the+eye+lens.">Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomyosin+3.5+protects+the+F-actin+networks+required+for+tissue+biomechanical+properties.">Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties.</a> Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomodulin+1+regulation+of+actin+is+required+for+the+formation+of+large+paddle+protrusions+between+mature+lens+fiber+cells.">Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).</li><li>Kuszak, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+lens+sutures.">The development of lens sutures.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 14 (2), 567-591 (1995).</li><li>Bassnett, S., Costello, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cause+and+consequence+of+fiber+cell+compaction+in+the+vertebrate+lens.">The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens.</a> Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).</li><li>Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+interlocking+domains+may+contribute+to+formation+of+membranous+globules+and+lens+opacity+in+ephrin-A5(-/-)+mice.">Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice.</a> Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).</li><li>Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+specializations+emerging+late+in+mouse+lens+fiber+cell+differentiation.">Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+eye+lens+biomechanics,+morphology,+refractive+index+and+transparency.">Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency.</a> Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2+affects+development+of+the+eye+lens+nucleus+and+the+gradient+of+refractive+index.">EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 63 (1), 2 (2022).</li><li>Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+application+of+glass+coverslips+to+assess+the+compressive+stiffness+of+the+mouse+lens:+strain+and+morphometric+analyses.">Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e53986 (2016).</li><li>Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E., Saunders, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+eye+and+orbit.">Anatomy of the eye and orbit.</a> The Eye (Fourth Edition). , 1 (2016).</li><li>Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+actin+filament+cytoskeleton:+Diverse+structures+for+complex+functions.">The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions.</a> Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).</li><li>Goldberg, M. W., Fiserova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+labeling+for+scanning+electron+microscopy.">Immunogold labeling for scanning electron microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).</li><li>Goldberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+electron+microscopy+and+immuno-gold+labeling+of+the+nuclear+lamina+and+nuclear+pore+complex.">High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex.</a> Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).</li><li>Hermann, R., Walther, P., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+labeling+in+scanning+electron+microscopy.">Immunogold labeling in scanning electron microscopy.</a> Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).</li><li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry,+transparency,+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens.">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu protokol, lensin çeşitli derinliklerinden demetlerin veya tekil lens fiber hücrelerinin 3D membran morfolojisini aslına uygun olarak koruyan fiksasyon, koruma ve immün boyama yöntemlerini göstermiştir. Lekeli lens lifleri, lens lifi hücre morfolojisini incelemek için uzun süredir kullanılan SEM preparatları ile karşılaştırılır. Sonuçlar, her iki preparat arasında karşılaştırılabilir membran yapılarını göstermektedir. EM, hücre morfolojisini incelemek için altın standart olmaya devam et...

Lens, gözün ön kamarasında epitelyal ve lif hücreleri 1 olmak üzere iki hücre tipinden oluşan şeffaf ve oval bir dokudur (Şekil 1). Lensin ön hemisferini kaplayan tek bir epitel hücresi tabakası vardır. Fiber hücreler epitel hücrelerinden ayrılır ve lensin büyük kısmını oluşturur. Son derece özelleşmiş lif hücreleri, lens çevresinden lens merkezinekadar hücre zarı morfolojisinde belirgin değişikliklerle işaretlenmiş bir uzama, farklılaşma ve olgunlaşma programlamasına tabi tutulur 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , lens çekirdeği olarak da bilinir. Merceğin retinaya çeşitli mesafelerden gelen ışığı ince odaklama işlevi, sertlik ve elastikiyetdahil olmak üzere biyomekanik özelliklerine bağlıdır 13,14,15,16,17,18,19. Lens liflerinin karmaşık interdigitasyonları20,21 olarak varsayılmıştır ve yakın zamanda lens sertliği22,23 için önemli olduğu gösterilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65638/65638fig01.jpg"> Şekil 1: Lens anatomi diyagramları ve lens liflerinden temsili taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri. Karikatür, epitel hücrelerinin ön tek tabakasının (açık mavi gölgeli) uzunlamasına (yukarıdan aşağıya) ve lens lifi hücrelerinin (beyaz) toplu bir kütlesini göstermektedir. Merceğin merkezi (pembe gölgeli) çekirdek olarak bilinir ve oldukça sıkıştırılmış fiber hücrelerden oluşur. Sağ tarafta, enine kesitli bir karikatür, bal peteği deseninde paketlenmiş lens liflerinin uzatılmış altıgen hücre şeklini ortaya koyuyor. Fiber hücrelerin iki geniş kenarı ve dört kısa kenarı vardır. Alt kısımdaki temsili SEM görüntüleri, lensin farklı derinliklerindeki lens fiber hücreleri arasındaki karmaşık membran geçişlerini gösterir. Sağdan, lens çevresinde yeni oluşan lens fiberlerinin kısa kenarları boyunca küçük çıkıntıları ve geniş kenarı boyunca bilyeler ve yuvalar vardır (kırmızı kutular). Olgunlaşma sırasında, lens lifleri, kısa kenarlar (mavi kutular) boyunca küçük çıkıntılarla süslenmiş büyük kürek alanları geliştirir. Olgun lif hücreleri, küçük çıkıntılarla gösterilen büyük kürek alanlarına sahiptir. Bu birbirine kenetlenen alanlar, lensin biyomekanik özellikleri için önemlidir. Mercek çekirdeğindeki lif hücreleri, kısa kenarları boyunca daha az küçük çıkıntıya sahiptir ve karmaşık dil ve oluk aralarına (mor kutular) sahiptir. Hücrenin geniş kenarları küresel bir zar morfolojisi gösterir. Karikatür22,32'den değiştirildi ve ölçeğe göre çizilmedi. Ölçek çubuğu = 3 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65638/65638fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Lens, önceki nesil liflerin üzerine bindirilmiş yeni lif hücrelerinin kabukları eklenerek büyür24,25. Fiber hücreler, iki geniş kenarı ve dört kısa kenarı olan uzun, altıgen bir kesit şekline sahiptir. Bu hücreler merceğin ön kutbundan arka kutbuna kadar uzanır ve türe bağlı olarak mercek liflerinin uzunluğu birkaç milimetre olabilir. Bu uzun ve ince hücrelerin yapısını desteklemek için, geniş ve kısa kenarlar boyunca özel interdigitasyonlar, lens şeklini ve biyomekanik özellikleri korumak için birbirine kenetlenen yapılar oluşturur. Fiber hücre farklılaşması ve olgunlaşması sırasında hücre zarı şeklindeki değişiklikler, elektron mikroskobu (EM) çalışmalarıile kapsamlı bir şekilde belgelenmiştir 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Yeni oluşan lif hücreleri, kısa kenarları boyunca çok küçük çıkıntılar ile geniş kenarları boyunca bilyeler ve yuvalara sahipken, olgun liflerin kısa kenarları boyunca birbirine kenetlenen çıkıntılar ve kürekler bulunur. Nükleer lifler, dil ve oluk arası sayısallıklar ve küresel zar morfolojisi gösterir. Bu karmaşık birbirine kenetlenen zarlar için gerekli olan proteinler hakkında çok az şey bilinmektedir. Fiber hücrelerde protein lokalizasyonu üzerine yapılan önceki çalışmalar, karmaşık hücre mimarisinin net bir şekilde görüntülenmesine izin vermeyen lens dokusu kesitlerine dayanıyordu.
Bu çalışma, karmaşık morfolojiyi korumak ve hücre zarındaki ve sitoplazmadaki proteinler için immün boyamaya izin vermek için tek ve demet lens lifi hücrelerini sabitlemek için yeni bir yöntem yarattı ve mükemmelleştirdi. Bu yöntem, EM çalışmalarından elde edilen verilerle karşılaştırılabilir hücre zarı mimarisini aslına uygun olarak korur ve spesifik proteinler için birincil antikorlarla boyamaya izin verir. Daha önce farklılaşma ve olgunlaşma geçiren immün kortikal lens lifleri vardı22,23. Bu protokolde, lens çekirdeğinden lif hücrelerini boyamak için yeni bir yöntem de vardır. Bu protokol, fiber hücre olgunlaşması ve lens çekirdeği sıkıştırması sırasında membran interdigitasyonlarındaki oluşum ve değişikliklerin mekanizmalarını anlamak için kapıyı açar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >100% Triton X-100</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm plate</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >16% paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X phosphate buffered saline</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1X phosphate buffered saline</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well plate</td>
			<td >CytoOne</td>
			<td >CC7672-7548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover slips (22 x 40 mm)</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12-553-467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Curved tweezers</td>
			<td >World Precision Instruments</td>
			<td >501981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection microscope</td>
			<td >Carl Zeiss</td>
			<td >Stereo Discovery V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine tip straight tweezers</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >72707-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software</td>
			<td >Carl Zeiss</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nail polish</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal donkey serum</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phalloidin (rhodamine)</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary antibody</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11</td>
			<td >VWR</td>
			<td >76241-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Secondary antibody</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight forceps</td>
			<td >World Precision Instruments</td>
			<td >11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#160;Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12-565-154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra-fine scissors</td>
			<td >World Precision Instruments</td>
			<td >501778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wheat germ agglutinin (fluorescein)</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >FL-1021-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens

Lens, gözün ön kamarasında bulunan ve net bir görüntü oluşturmak için ışığı retinaya ince bir şekilde odaklamak için şekil değiştiren şeffaf ve elipsoid bir organdır. Bu dokunun büyük kısmı, altıgen bir kesite sahip olan ve lensin ön kutuplarından arka kutuplarına kadar uzanan özel, farklılaşmış lif hücrelerinden oluşur. Bu uzun ve sıska hücreler, komşu hücrelere sıkı sıkıya karşıdır ve hücrenin uzunluğu boyunca karmaşık iç içe geçmelere sahiptir. Özel birbirine kenetlenme yapıları, lensin normal biyomekanik özellikleri için gereklidir ve elektron mikroskobu teknikleri kullanılarak kapsamlı bir şekilde tanımlanmıştır. Bu protokol, bu karmaşık şekilli hücreler içindeki proteinlerin ayrıntılı lokalizasyonuna izin vermek için tekil ve fare lens lifi hücrelerinin demetlerini korumak ve immün boyamak için ilk yöntemi gösterir. Temsili veriler, merceğin tüm bölgelerinde periferik, farklılaşan, olgun ve nükleer fiber hücrelerin boyandığını gösterir. Bu yöntem potansiyel olarak diğer türlerin lenslerinden izole edilen lif hücrelerinde kullanılabilir.

The lens is a clear and ovoid tissue in the anterior chamber of the eye that is made up of two cell types, epithelial and fiber cells1 (Figure 1). There is a monolayer of epithelial cells that covers the anterior hemisphere of the lens. Fiber cells are differentiated from epithelial cells and make up the bulk of the lens. The highly specialized fiber cells undergo an elongation, differentiation, and maturation programming, marked by distinct changes in cell membrane morphology from the lens periphery to the lens center2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, also known as the lens nucleus. The function of the lens to fine-focus light coming from various distances onto the retina depends on its biomechanical properties, including stiffness and elasticity13,14,15,16,17,18,19. The complex interdigitations of lens fibers have been hypothesized20,21 and recently shown to be important for lens stiffness22,23.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65638/65638fig01.jpg" /> 
Figure 1: Lens anatomy diagrams and representative scanning electron microscopy (SEM) images from lens fibers. The cartoon shows a longitudinal (anterior to posterior from top to bottom) view of the anterior monolayer of epithelial cells (shaded in light blue) and a bulk mass of lens fiber cells (white). The center of the lens (shaded in pink) is known as the nucleus and comprises highly compacted fiber cells. On the right, a cross-section cartoon reveals the elongated hexagon cell shape of lens fibers that are packed into a honeycomb pattern. Fiber cells have two broad sides and four short sides. Representative SEM images along the bottom show the complex membrane interdigitations between lens fiber cells at different depths of the lens. From the right, newly formed lens fibers at the lens periphery have small protrusions along the short sides and balls-and-sockets along the broad side (red boxes). During maturation, lens fibers develop large paddle domains that are decorated by small protrusions along the short sides (blue boxes). Mature fiber cells possess large paddle domains illustrated by small protrusions. These interlocking domains are important for lens biomechanical properties. Fiber cells in the lens nucleus have fewer small protrusions along their short sides and have complex tongue-and-groove interdigitations (purple boxes). The broad sides of the cell display a globular membrane morphology. The cartoon was modified from22,32 and not drawn to scale. Scale bar = 3 &#181;m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65638/65638fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The lens grows by adding shells of new fiber cells overlaid on top of previous generations of fibers24,25. Fiber cells have an elongated, hexagonal cross section shape with two broad sides and four short sides. These cells extend from the anterior to the posterior pole of the lens, and depending on the species, the lens fibers can be several millimeters in length. To support the structure of these elongated and skinny cells, specialized interdigitations along the broad and short sides create interlocking structures to maintain the lens shape and biomechanical properties. Changes in cell membrane shape during fiber cell differentiation and maturation have been extensively documented by electron microscopy (EM) studies2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29. Newly formed fiber cells have balls-and-sockets along their broad sides with very small protrusions along their short sides, while mature fibers have interlocking protrusions and paddles along their short sides. Nuclear fibers display tongue-and-groove interdigitations and globular membrane morphology. Little is known about the proteins that are required for these complex interlocking membranes. Previous studies on protein localization in fiber cells have relied on lens tissue sections, which do not allow clear visualization of the complex cell architecture.
This work has created and perfected a novel method to fix single and bundles of lens fiber cells to preserve the complex morphology and to allow immunostaining for proteins at the cell membrane and within the cytoplasm. This method faithfully preserves cell membrane architecture, comparable to data from EM studies, and allows staining with primary antibodies for specific proteins. We have previously immunostained cortical lens fibers undergoing differentiation and maturation22,23. In this protocol, there is also a new method to stain fiber cells from the lens nucleus. This protocol opens the door to understanding the mechanisms for formation and changes in membrane interdigitations during fiber cell maturation and lens nucleus compaction.

Yazar Gündemi: Karmaşık Sayısallaştırmaları ve Protein Boyamayı Görüntülemek için Yeni Bir Protokol Aracılığıyla Lens Biyomekaniği Araştırmalarını İlerletmek 

Göz Merceğinin Korteks ve Çekirdeğinden Demetlerin ve Tek Fiber Hücrelerin Hazırlanması ve İmmünofloresan Boyanması

Lens lifi hücreleri, lens korteksi (farklılaşan lifler ve olgun lifler) ve çekirdekten hazırlanır ve hücreler, hücre zarı için F-aktin ve WGA için falloidin ile boyanır. Hücre demetlerinin veya tek mercek liflerinin bir karışımı (Şekil 3) gözlenir ve görüntülenir. Lens korteksinden iki tip hücre bulunur (Şekil 3A). Lens çevresindeki farklılaşan fiber hücreler düzdür ve kısa kenarları boyunca çok küçük çıkıntılar vardır. H...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Lens Biomechanics Research Through a Novel Protocol for Imaging Complex Interdigitations and Protein Staining at JoVE.com

Bu protokol, karmaşık hücreden hücreye interdigitasyonları ve membran mimarisini incelemek için periferik, olgun ve nükleer göz merceği fiber hücrelerini immünofloresan boyama için hazırlama yöntemlerini açıklar.

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...

Lens, gözün ön kamarasında bulunan şeffaf bir elipsoid organdır ve net bir görüntü oluşturmak için ışığın retinaya ince odaklanmasından sorumludur. Lensin işlevi biyomekanik özelliklerine dayanır, lens fiber hücreleri arasındaki karmaşık interdigitasyonların lens sertliği için önemli olduğu son zamanlarda gösterilmiştir. Mercek lifi hücrelerinin özel morfolojisi daha önce elektron mikroskobu ile tanımlanmış olsa da, bu birbirine kenetlenen zarlar için gerekli olan proteinler hakkında çok az şey bilinmektedir.Önceki çalışmalar, karmaşık hücre mimarisinin net bir şekilde görselleştirilmesine izin vermeyen lens dokusu kesitlerine dayanıyordu. Spesifik proteinlerin boyanması ve konfokal mikroskopi görüntülemesi için lens lifi hücreleri arasındaki karmaşık membran interdigitasyonlarını aslına uygun olarak korumak için yeni bir teknik oluşturduk ve mükemmelleştirdik. Bu protokolde, lens çekirdeği olarak da bilinen lensin merkezinden fiber hücrelerin boyanması için yeni bir yöntem de vardır.Bu yöntem, zar sayısallıklarındaki oluşum mekanizmalarını ve değişiklikleri inceleyerek lif hücresi farklılaşmasını ve olgunlaşmasını anlamanın kapısını açar.

preparation-immunofluorescence-staining-bundles-single-fiber-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

1.1K Görüntüleme.  Indiana University. Lens, gözün ön kamarasında bulunan şeffaf bir elipsoid organdır ve net bir görüntü oluşturmak için ışığın retinaya ince odaklanmasından sorumludur. Lensin işlevi biyomekanik özelliklerine dayanır, lens fiber hücreleri arasındaki karmaşık interdigitasyonların lens sertliği için önemli olduğu son zamanlarda gösterilmiştir. Mercek lifi hücrelerinin özel morfolojisi daha önce elektron mikroskobu ile tanımlanmış olsa da, bu birbirine kenetlenen zarlar için ger...

Video: Yazar Gündemi: Karmaşık Sayısallaştırmaları ve Protein Boyamayı Görüntülemek için Yeni Bir Protokol Aracılığıyla Lens Biyomekaniği Araştırmalarını İlerletmek 

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear image. The bulk of this tissue comprises specialized, differentiated fiber cells that have a hexagonal cross section and extend from the anterior to the posterior poles of the lens. These long and skinny cells are tightly opposed to neighboring cells and have complex interdigitations along the length of the cell. The specialized interlocking structures are required for normal biomechanical properties of the lens and have been extensively described using electron microscopy techniques. This protocol demonstrates the first method to preserve and immunostain singular as well as bundles of mouse lens fiber cells to allow the detailed localization of proteins within these complexly shaped cells. The representative data show staining of the peripheral, differentiating, mature, and nuclear fiber cells across all regions of the lens. This method can potentially be used on fiber cells isolated from lenses of other species.

This protocol describes methods to prepare peripheral, mature, and nuclear eye lens fiber cells for immunofluorescence staining to study complex cell-to-cell interdigitations and the membrane architecture.