Enuclear los ojos de un ratón sacrificado, marcando el lado temporal con fines de orientación. Retire la cámara anterior. A continuación, retire el cristalino y el vítreo y coloque las copas oculares en paraformaldehído durante 30 minutos.
Lave las copas de los ojos con PBS durante 30 minutos. Reemplazar la solución tres veces. A continuación, lavar con Triton X-100 al 0,5% durante 30 minutos.
Incubar las copas oculares en el tampón de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente. Después de la inmunotinción, aísle las retinas de las copas oculares con un microscopio. Divida las retinas en cuatro hojas y móntelas con la capa de células ganglionares de la retina hacia arriba.
Asegúrese de que la marca en el lado temporal permanezca adherida para orientarse. Cubra las retinas con medio de montaje. Coloque los cubreobjetos.
Y sella las diapositivas con esmalte de uñas. Encienda el microscopio confocal y, en el modo Localizar, busque el área de interés con el ocular. Cambie al modo de adquisición y configure mosaicos para cubrir toda la retina, junto con cortes Z-Stack para todas las capas de información.
Visualiza al menos 25 mosaicos en toda la retina para lograr un volumen total. Proyecte los cortes de Z-Stack para generar imágenes bidimensionales de microscopía confocal en la cara. El fitragrama compuesto vis-OCT se compara con la imagen confocal correspondiente de la retina de montaje plano inmunoteñida con TuJ1 para los axones de RGC.
Los vasos sanguíneos exhiben estructuras ramificadas distinguibles que pueden coincidir con los vasos sanguíneos marcados con ICAM-2 en la imagen confocal. La comparación lado a lado entre la microscopía confocal ex vivo y la vis-OCT in vivo reveló redes idénticas de haces de axones de RGC y vasculatura retiniana circundante.
