La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación de la Unión Europea del Séptimo Programa Marco (FP7/2007-2013) bajo acuerdos de subvención n. 228334 y 241526. Este proyecto de investigación ha sido apoyada también por la beca de investigación Human Frontier Science Program (RGP0027/2009), y por el Ministerio de Educación, Universidad e Investigación en el marco del Proyecto Nanomax Flagship italiano y por el Ministerio de Sanidad italiano, en el marco de la &quot;Células Madre Convocatoria de propuestas&quot;. Esta investigación se ha llevado a cabo en el marco de las actividades de investigación de la fundación ICON apoyados por &quot;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&quot;.

1. Preparación del tejido y almacenamiento <ol><li> Fijar cerebro de ratón a través de la perfusión transcardial estándar 13 con 20 ml de 0,01 M tampón fosfato salino (PBS), seguido por 100 ml de paraformaldehído al 4% en 0,01 M de PBS. Ajustar cuidadosamente el pH de ambas soluciones a 7,6: valores ligeramente más bajos de pH pueden extinguir la fluorescencia de EGFP. </li><li> Post-fijar los cerebros extirpados durante la noche en paraformaldehído al 4% a 4 ° C. </li><li> Enjuague dos veces (30 min cada uno) en 0,01 M de PBS y guardar en 0,01 M de PBS a 4 ° C. </li></ol> 2. Deshidratación y Compensación Nota: el protocolo para la deshidratación y la limpieza sigue de cerca el descrito por Becker et al 10. <ol><li> Para eliminar los peróxidos del disolvente deshidratación (tetrahidrofurano, THF), que saciar fuertemente la fluorescencia XFP, THF filtro con óxido de aluminio activado básica (Grado de actividad Brockman I, aproximadamente 250 g / l de THF) utilizando un cromatografía de columna. Evitar el agrietamiento de la columna, lo cual reduciría la eliminación de peróxido. </li><li> Añadir estabilizador (hidroxitolueno butilado, 250 mg / L) a la solución final, incluso si el THF ya se estabilizó antes de la filtración. Estabilizador De hecho, es retenido por el óxido de aluminio: THF sin estabilizador puede desarrollar grandes cantidades de peróxidos y puede ser explosiva y peligrosa. </li><li> Deshidratar todo el cerebro de ratón en una serie graduada de THF en agua pura: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 h cada uno, a continuación, 100% durante la noche. Colocar el vial con la muestra en una rueda giratoria. Para evitar la exposición a la luz, envolver los viales con una lámina de aluminio. </li><li> Se filtra el disolvente de compensación (éter de dibencilo, DBE) con óxido de aluminio (activado básica, grado de actividad de Brockman I, aproximadamente 250 g / L de DBE) usando un embudo de filtración. </li><li> Desactive la muestra en 100% DBE. Cambie la solución después de 3 y 6 hr. </li></ol> 3. Espécimen de montaje <ol><li> Cuando el cerebro se ve transparente a simple vista (típicamentemente 1 hora después del segundo cambio DBE), montar en la placa de imagen de punta por uno de los siguientes métodos: </li><li><ol><li> Montaje directo - hundir suavemente la muestra en una de las extremidades (Figura 3a). </li><li> Disco de agarosa - Sumérgete en un disco hecho de un 6% en gel de agarosa en las puntas. Fijar la muestra cuidadosamente en el disco de agarosa con pegamento acrílico (Figura 3b). Espere aproximadamente 1 minuto para el curado. </li><li> Vaso de precipitados de agarosa - Sumérgete un vaso hecho de un 3% en gel de agarosa en las puntas. Colocar suavemente la muestra en la parte inferior del vaso de precipitados (Figura 3c). </li></ol></li></ol> Nota 1: montaje en vaso de precipitados de agarosa debe ser preferible cuando es importante imágenes de la muestra en su totalidad, sin embargo, el gel de agarosa que rodea la muestra da lugar a dispersión de la luz adicional que podría ser perjudicial para la calidad de la imagen. Si una pequeña parte de la muestra podría ser excluido de la proyección de imagen, es preferible montar la especificaciónimen en el disco de agarosa o directamente en la punta. El primer método es el más adecuado para mantener el cerebro horizontal (excluyendo de imágenes de una porción ventral o dorsal del cerebro), este último para mantener el cerebro vertical (con exclusión de la imagen de una parte de los bulbos olfativos o de la médula espinal). Nota 2: el gel de agarosa se debe preparar en agua, después se deshidrata con THF (50% y 100% de 4 horas cada una) y se aclaró en DBE 100% durante 4 horas o hasta que se vea con claridad transparente. <ol start="3"><li> Después de montar la muestra siguiendo uno de los métodos anteriores, la posición de la placa de imagen dentro de la cámara de la muestra con unas pinzas. Llene la cámara con la limpieza de la solución. </li></ol> 4. Preparación de Positrones <ol><li> Retire la ranura para recoger la mayor cantidad de fluorescencia posible. </li><li> Ilumine la muestra con láser de baja potencia para evitar photobleaching. </li><li> Mueva la muestra en las tres direcciones utilizando el microposicionamiento syste por softwarem. Identificar para cada dirección de la coordenadas mínima y máxima para la cual se ilumina la muestra y está dentro del campo de visión de la cámara (Figura 4a). </li><li> Introduzca las coordenadas anteriores como parámetros para la subrutina &#39;Pre-tomografía&#39;. Especificar también la distancia entre las pilas adyacentes para ser utilizado en la tomografía, y el paso de muestreo de pre-tomografía en dirección z. </li><li> Inicie el pre-tomografía, que recoge las imágenes en cada pila con la toma de muestras z especificada en (4,4). </li></ol> Nota: Las imágenes recogidas se utilizan por un software para preparar un mapa aproximado de la forma del espécimen y la posición (Figura 4b), que permite la restricción de adquisición tomografía sólo para el volumen realmente ocupado por la muestra, reduciendo el tiempo de formación de imágenes y, por tanto photobleaching. 5. Tomografía de Adquisición <ol><li> Mueva la muestra fuera de la hoja de la luz utilizando el sistema microposicionamiento. </li><li> Incpotencia del láser Rease y detener el movimiento de todos los sistemas de escaneo, con el fin de iluminar sólo una línea fija en el centro del campo de visión. </li><li> Monte la hendidura y alinearlo utilizando la señal de autofluorescencia de la solución de limpieza. Usted debe ver claramente la línea de corte en el centro del campo de visión. </li><li> Vuelva a activar el sistema de exploración, reducir la potencia del láser y mover la muestra dentro de la hoja de la luz utilizando el sistema microposicionamiento. Tenga en cuenta que la potencia del láser utilizado con la ranura será más alta que la utilizada sin él, ya que los bloques de filtros espaciales una fracción no despreciable de la luz. </li><li> Ajuste la amplitud y el desplazamiento de los sistemas de la exploración y de-escaneo con el software de control, hasta que las imágenes se ven claras y brillantes. </li><li> Ejecute el software de adquisición de la tomografía, después de ajustar el paso z apropiado para el experimento. El volumen será reflejado en muchos paralelos, parcialmente pilas superpuestas (Figura 5), y las imágenes se guardarán enuna estructura jerárquica de carpetas. </li></ol> 6. Costuras y Visualización <ol><li> Completar el volumen adquirido con imágenes negras sintéticos (es decir, imágenes de un mismo tipo y dimensiones de los recogidos queridos-, pero con intensidad cero) utilizando un software automatizado (Figura 4c). Este paso es obligatorio para que el software de costura para hacer frente a un volumen cúbico completo. </li><li> Software Vaa3D lanzamiento (descargable gratuitamente desde <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> ) con los plugins instalados TeraStitcher y TeraManager. </li><li> Cargar el plug-in TeraStitcher. Seleccione el directorio que contiene el volumen reflejado, indicar las orientaciones relativas de los ejes (con respecto a una referencia para diestros sistema de coordenadas) y el tamaño de voxel. </li><li> Lanzamiento de la primera parte de la costura. El software calcula el desplazamiento relativo entre las parejas de pilas, y encontrar una Placem óptimo globalent para todas las pilas juntas (Figura 5b). </li><li> Seleccione para guardar el volumen cosido en una sola resolución o en formato multi-resolución. Este último permite a la multi-resolución de visualización con el plugin TeraManager. En ambos casos, si la imagen de mayor resolución es mayor que unos pocos gigabytes, seleccione también el multi-pila ahorro modalidad y especificar el tamaño del substacks individuales. Esto permitirá un acceso eficiente a los datos almacenados. </li><li> Inicie la segunda parte de la costura. El software se fusionará las pilas alineadas, y guardarlos en cualquiera de los modos-stack múltiples de una o (Figuras 5c y 5d). Al final cerrar el plugin TeraStitcher. </li><li> Cargar el plug-in TeraManager. Seleccione la carpeta con el volumen multi-resolución multi-apilado, e indicar el tamaño de voxel y hachas orientaciones. El volumen se cargará en la resolución mínima. </li><li> Para acercarse a una resolución mayor, seleccione un punto de referencia con el botón derecho del ratón modality de Vaa3D, entonces hacer un zoom mediante desplazamiento del ratón. Alternativamente, usted puede seleccionar directamente el retorno de la inversión para ampliar la imagen con el botón derecho del ratón, o especificar las coordenadas del volumen de interés. </li><li> Para volver a la resolución más baja, sólo tiene que utilizar el scroll del ratón. </li></ol>

<ol>
	<li>Lichtman, J. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+big+and+the+small:+challenges+of+imaging+the+brain's+circuits.">The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits.</a> Science. 334, 618-623 (2011).</li><li>Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain.">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> J. Microsc. 231, 134-143 (2008).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain.">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330, 1404-1408 (2010).</li><li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+tracing+brain-wide+long-distance+axonal+projections+in+mice+at+a+one-micron+voxel+resolution.">Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution.</a> Neuroimage. 74, 87-98 (2013).</li><li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging.">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Dodt, H. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Bria, A., Iannello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TeraStitcher+-+A+Tool+for+Fast+Automatic+3D-Stitching+of+Teravoxel-Sized+Microscopy+Images.">TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images.</a> BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberration+correction+for+confocal+imaging+in+refractive-index-mismatched+media.">Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media.</a> J. Microsc. 192, 90-98 (1998).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy.">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

CLSM junto con la limpieza química representa una poderosa herramienta para el estudio de la neuroanatomía de los cerebros enteros de ratón marcado con sondas fluorescentes, proteínas o los tintes sintéticos. Dado que la luz emitida fuera del plano focal está bloqueado por un filtro espacial física, imágenes de alto contraste es posible también en muestras gruesas, mientras que el mantenimiento de las altas tasas de cuadros típicos de la arquitectura de lámina de luz. El principal problema para hacer frente a cuando se usan los métodos descritos es la maximización del contraste. De hecho, la señal disponible se reduce tanto por factores químicos y ópticos. Desde el punto de vista químico, los procedimientos de compensación basados ​​en disolventes orgánicos pueden saciar las emisiones a partir de proteínas fluorescentes y otros tintes fluorescentes 7. La filtración del disolvente para eliminar peróxidos, como se ha descrito por Becker et al. 10, permite el mantenimiento de un buen nivel de fluorescencia también en los tejidos de disolvente despejado. Publicarmétodos de compensación a base de agua ED 14 no reducen la eficiencia de fluorescencia, pero dan como resultado más pobre transparencia cuando se trata de cerebros enteros murinos, al menos con técnicas ópticas lineales. Por otro lado, por el momento no existen objetivos comerciales con distancia de trabajo corregidos por el alto índice de refracción (n ≈ 1,56) desatascar las soluciones utilizadas. Por lo tanto, el desajuste del índice de refracción entre el medio en el que se sumerge la muestra y el diseño de uno de los objetivos da lugar a fuertes aberraciones esféricas. Además de reducir la resolución del microscopio, tales aberraciones resultan en una caída de la intensidad de la imagen y el contraste, ya que la luz se esparce sobre un área más amplia. Las posibles soluciones para este problema incluyen el uso de óptica adaptativa 15 y / o correctores asféricas estáticas. Cualquier mejora en el contraste de la imagen y la intensidad afecta fácilmente también la velocidad de imagen, ya que una más corta entiempo de integración por imagen puede ser elegido. En el momento CLSM puede permitirse una velocidad de imagen de aproximadamente 10 6 m 3 / seg, con un tiempo de exposición de la cámara de 100 mseg 9. A esta velocidad se tarda 1-3 días para la imagen de un cerebro de ratón entero, dependiendo del tamaño de la muestra. Aunque sin degradación significativa de la calidad de la imagen se observa a lo largo de dicha sesión de imágenes de largo, en su mayoría debido a la baja fotoblanqueo intrínseca de hoja de luz de iluminación 6, el largo tiempo necesario para una sola imagen del cerebro del ratón, en la práctica podría reducir la aplicabilidad de CLSM. Un aumento de 10 veces en la eficiencia del sistema, junto con el uso de una cámara de alta velocidad para la detección, reduciría el tiempo de formación de imágenes para varias horas, lo que permite un uso rutinario del protocolo descrito. A pesar de todas las limitaciones mencionadas, CLSM imágenes junto a la limpieza química de los tejidos permite reconstruir los cerebros enteros de ratón con una resolución de escala micrométrica en menos de unsemana. Otros métodos ópticos para imágenes del cerebro entero ofrecen mayor resolución que CLSM, pero al precio de una preparación más prolongada y / o el tiempo de formación de imágenes 2-4, o de un z escasa toma de muestras 5. Los métodos descritos en este artículo se pueden usar en combinación con diferentes estrategias para el marcaje fluorescente: animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en subconjuntos seleccionados neuronales, la transfección vírica, inyección de colorante intraparenquimatosa, etc En la práctica, todas las estrategias de tinción precedentes sacrificio de animales son compatibles con CLSM . De hecho, el marcaje fluorescente post-mortem de los cerebros enteros de ratón no se ha demostrado hasta ahora, de todos modos, si tal clase de tinción sería posible en un futuro próximo, el número de ejemplares que pueden ser reconstruidas con CLSM se convertirá en mucho más grande, potencialmente incluyendo el tejido cerebral humano. En conclusión, la microscopía confocal de lámina de luz utilizada en combinación con tisclaro sue y gestión de datos multi-resolución puede permitir a los investigadores reconstruir y analizar muestras macroscópicas de la resolución en la escala del micrón, con esfuerzos tecnológicos que están bien de la mano de la mayoría de los laboratorios. Las aplicaciones potenciales de MBRC son, por supuesto, no se limita a la neurociencia, pero se extiende por todos los campos de investigación en los que la microscopía de lámina de luz que ya se ha utilizado, como la embriogénesis 16,17 y la anatomía de los animales pequeños 18.

Cuando se compara a nuestra comprensión de la función cerebral subyacente mecanismos moleculares y celulares, nuestro conocimiento de la neuroanatomía se ve bien todavía en su infancia 1. De hecho, todavía carecemos de mapas detallados de la posición de los cuerpos celulares neuronales o de proyecciones a largo plazo en todo el cerebro. En realidad, muchos de los esfuerzos tecnológicos se dedican a reconstruir el cerebro del ratón con resolución microscópica. Los métodos ópticos basados ​​en la serie de corte de muestras embebido en resina, como Knife-Edge Scanning Microscopy (KESM) 2, Micro-óptica Seccionamiento Positrones (MOST) 3 y fluorescencia-MOST (fMOST) 4, puede proporcionar sub-micras de resolución en tres dimensiones imágenes de los cerebros enteros de ratón. Sin embargo, el tiempo total necesario para la preparación y formación de imágenes de una sola muestra es del orden de varias semanas, lo que limita la aplicación práctica de tales métodos. Otra técnica basada en el seccionamiento de serie (pero sin la incrustación de resina), de serie en dosPhoton tomografía (STP) 5, permite obtener imágenes de alta resolución en tres dimensiones. Sin embargo, esta técnica se ha demostrado en los cerebros de ratón enteros sólo con una toma de muestras muy escasa, la recogida de la sección 1 de cada 50 micras 5, y para nuestro conocimiento STP no han producido todavía una reconstrucción de muestreo completo de un cerebro murino. Un método óptico de última generación para reconstruir especímenes completos en tres dimensiones a gran velocidad es hoja de microscopía de luz 6. En este esquema óptico de la muestra es iluminada con una lámina delgada de luz y la emisión de fluorescencia se recoge a lo largo de un eje perpendicular al plano de iluminación. De esta manera sólo fluoróforos en foco están entusiasmados y es posible lograr seccionamiento óptico de configuración de campo amplia, garantizando alta velocidad de fotogramas. Cuando se acopla a la limpieza de los protocolos basados ​​en la sustitución de agua con un líquido de adaptación de índice de refracción 7, microscopía de hoja de luz se ha aplicado amuestras macroscópicas, como todo el cerebro del ratón 8. Sin embargo, la muestra inducida por dispersión de la luz, que afecta a los especímenes aún despejados, degrada la lámina de luz que conduce a la excitación de los fluoróforos fuera de foco que se suma un total desenfoque de las imágenes adquiridas. Para recoger selectivamente sólo los fotones en foco, hace poco acoplada luz de iluminación hoja a un esquema de detección confocal 9. En confocal de microscopía de luz de hoja (CLSM), fuera de foco y los fotones dispersados ​​son rechazados por un filtro espacial lineal (ITSL) antes de la detección (Figura 1). Para lograr un funcionamiento confocal en la arquitectura de lámina de luz, la iluminación se produce por medio de una línea de exploración, y un sistema de barrido en la trayectoria de detección crea una imagen estática de la línea de exploración de la excitación a la ubicación de la ranura. Un tercer sistema de escaneo reconstruye una imagen bidimensional en el sensor de la cámara. CLSM ofrece una mejora del contraste del 100% en el ratón despejadocerebros con respecto a la microscopía de luz convencional hoja, mientras se mantiene una tasa de 10 Hz marco. Con CLSM es posible reconstruir los cerebros enteros de ratón con la resolución de 2 micras de XY y 9 micras de Z, y con un contraste suficiente para discernir las neuronas sola etiqueta fluorescente. En este artículo describimos la tubería experimental de reconstruir un cerebro de ratón con CLSM. Cerebros de ratón de aldehído-fijo se deshidratan en una serie graduada de tetrahidrofurano exento de peróxidos y posteriormente liquidadas en libre de peróxido de dibencilo éter (Figura 2), siguiendo el protocolo desarrollado por Becker et al. 10 El espécimen limpiado luego se monta con cuidado sobre una punta placa y se coloca en la cámara de imágenes de un microscopio confocal de lámina de luz a medida. La muestra se puede montar directamente al sumergirse en una punta de la placa (Figura 3a), alternativamente, se puede pegar en un disco de gel de agarosa borrado (Figura3b) o colocado en la cavidad de un vaso de precipitados hecha de gel de agarosa borrado (Figura 3c). A continuación se realiza una tomografía óptica de todo el cerebro, como muchas pilas adyacentes paralelas se adquieren para cubrir todo el volumen del cerebro (Figura 4). Un muestreo de pre-tomografía, que produce un mapa aproximado de la posición de la muestra y la forma, garantiza que las imágenes se lleva a cabo sólo en el volumen ocupado por la muestra. Las pilas de tomografía son posteriormente cosidos con software a medida y se guardan en un esquema jerárquico de resolución múltiple 11. Cerebros de los ratones con el tiempo se pueden explorar con el software multi-resolución de visualización de Google Maps-como prototipos. Ambos instrumentos de software se integran como plugins en la plataforma de código abierto Vaa3D 12. Finalmente mostramos imágenes representativas de cerebros de ratón para demostrar las capacidades de la tubería experimental descrito en el estudio de multa neuroanatom murinoY.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline Tablets</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417_100TAB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde</td>
 <td>Agar Scientific</td>
 <td>R1018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peroxide-free Tetrahydrofuran</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>186562</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>199443</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dibenzyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>108014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Butylated hydroxytoluene</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>W218405 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose Type III-A, High EEO</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9793</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acrylic glue</td>
 <td>Bostik</td>
 <td>D2498</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaa3D software</td>
 <td>open source</td>
 <td></td>
 <td>freely downloadable from <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

micron-scale resolution optical tomography of entire mouse brains with confocal light sheet microscopy

Descripción de la arquitectura del cerebro de los mamíferos con una resolución de una sola célula es una de las cuestiones clave de la neurociencia. Sin embargo, la cartografía de soma neuronal y las proyecciones a lo largo de todo el cerebro sigue siendo un reto para las tecnologías de imagen y gestión de datos. De hecho, los volúmenes macroscópicos necesitan ser reconstruido con alta resolución y contraste en un plazo razonable, la producción de conjuntos de datos en el rango terabyte. Recientemente hemos demostrado un método óptico (microscopía confocal de luz de hoja, CLSM), capaces de alcanzar la reconstrucción a escala micrométrica de cerebros enteros de ratón marcado con aumento de proteína verde fluorescente (EGFP). La combinación de luz de iluminación general y de detección confocal, CLSM permite obtener imágenes en el interior de las muestras macroscópicas compensados ​​con un alto contraste y velocidad. Aquí se describe la tubería experimental completa para obtener imágenes completas y legibles de los cerebros enteros de ratón marcadas con proteínas fluorescentes. La compensación y la p de montajeROCEDIMIENTOS se describen, junto con los pasos para realizar una tomografía óptica en todo su volumen mediante la adquisición de muchas pilas adyacentes paralelas. Demostramos el uso de herramientas de software a medida de código abierto que permite la costura de las múltiples pilas y navegación de datos multi-resolución. Por último, hemos ilustrado algunos ejemplos de mapas cerebrales: el cerebelo de un ratón transgénico L7-GFP, en la que todas las células de Purkinje están etiquetados de forma selectiva, y todo el cerebro de un ratón Thy1-GFP-H, caracterizado por un etiquetado neuronal escasa aleatoria.

El protocolo descrito se puede utilizar para reconstruir con la resolución, ya sea cerebros de ratón enteros a escala micrométrica o partes escindidas, sin la necesidad de seccionamiento física. Como resultado representativo, en la figura 6 se muestra todo el cerebelo de un ratón L7-GFP (día postnatal 10). En este animal todas las neuronas de Purkinje están etiquetados con EGFP. Si nos acercamos, la estructura laminar típica de la corteza cerebelosa puede verse (Figura 7). Además, en el zoom permite distinguir claramente cada soma de células de Purkinje (Figura 8). El protocolo descrito por lo tanto se puede utilizar para detectar organización espacial neuronal en diversos estudios del desarrollo neurológico. Como segundo resultado representativo, se presentan las imágenes del cerebro de un unsectioned thy1-GFP-M de ratón adulto. En este animal transgénico EGFP se expresa en un subconjunto neuronal escasa aleatoria. La mitad derecha del cerebro se muestra en la Figura 9. Comozoom-in más y más (Figuras 10 y 11), los procesos neuronales se vuelven distinguibles. Este resultado demuestra que el protocolo descrito permite formación de imágenes de resolución a escala micrométrica en los cerebros enteros de ratón adulto, abriendo la posibilidad de estudiar la anatomía de todo el cerebro en resolución celular en modelos de ratón de enfermedad neurodegenerativa. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema óptico confocal de microscopía de luz de hoja (CLSM). (A) Vista superior del aparato, mostrando la vía de excitación. Emisión láser desde un estado sólido (DPSS) láser bombeado por diodo de 488 nm, después de la expansión y la colimación por un primer telescopio, entra en un filtro sintonizable acústico-óptico (AOTF) que regula la intensidad del haz. Luego, un segundo telescopio amplía aún más la viga. Un espejo galvo el vertical (y) explora el ser<html> am, que se centra por una lente dentro de la cámara de la muestra. (b) Vista lateral del aparato, mostrando la vía de detección. Luz recogida por el objetivo de detección se descanned verticalmente por un espejo galvo y enfocada por una lente, produciendo una imagen fija de la línea de excitación en movimiento. En la posición de la imagen fija se coloca un filtro espacial lineal (hendidura). Después de la hendidura, un espejo galvo colocado dentro de un sistema de lentes 4f reconstruye una imagen 2-dimensional en el chip de un dispositivo de acoplamiento de carga de electrones multiplicando (EM-CCD). Un filtro de paso de banda de fluorescencia eliminar toda la luz difusa de excitación antes de la detección. Rayos representativos de excitación, la detección y la luz de detección de paso de banda con filtro son representados por los rayos azules y verdes azules, luz, respectivamente. Las distancias focales de todos los lentes realmente utilizados en el microscopio se indican. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> Figura 2. Compensación de la pieza. Cerebros de ratón fijadas con formaldehído, que se almacenan en PBS 0,1 M a 4 ° C (a), se deshidratan en una serie graduada de tetrahidrofurano (THF, b) y, posteriormente, se aclaró en 100% de dibencil-éter (DBE , c). La etapa de deshidratación provoca también una cierta contracción del tejido. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Figura 3. De la pieza de montaje para la formación de imágenes CLSM. El cerebro aclarado puede ser sumergida directamente en la placa de montaje con punta (a), pegada sobre un disco de agarosa borrado (b), o insertado en un vaso de precipitados de agarosa (c) aclarado. Figura 4. Adquisición de Positrones. Los pre-tomografía muestras de rutina de un paralelepípedo que contiene el cerebro (a) para definir el número y la duración de las pilas adyacentes paralelos necesarios para la imagen de todo el espécimen (b). Después de la tomografía, imágenes en negro se generan para completar el volumen adquirido virtual a un paralelepípedo (c). <img alt="La figura 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> Figura 5. Costura Volumen. La imagen obtenida se acumula se solapan parcialmente entre sí (a), lo que permite su alineación precisa con el plugin TeraStitcher (b). El plugin continuación, combina las pilas alineadas en un único apilados (c) o multi-stacked (d) la representación multi-resolución. <img alt="La figura 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> Figura 6. Todo el cerebelo de un ratón L7-GFP P10, en el que todas las neuronas de Purkinje están etiquetados con EGFP. Barra de escala, 1 mm. <img alt="La figura 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Figura 7. Zoom-en de una porción del cerebelo se muestra en la Figura 6, que muestra la estructura laminar típica de la corteza cerebelosa. Barra de escala, 500 micras. <img alt="Figura 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Figura 8. Además de zoom-en de una porción del cerebelo se muestra en la Figura 6. Células de Purkinje soma puede ser claramente distinguired. La barra de escala, 200 m. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> La Figura 9. La mitad derecha del cerebro de un thy1-GFP-M ratón adulto, que se caracteriza por una escasa inespecíficos etiquetado EGFP neuronal. Barra de escala, 1 mm. <img alt="Figura 10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Figura 10. Zoom-en de una porción de la mitad del cerebro se muestra en la Figura 9, que muestra parte del hipocampo y de la corteza. Barra de escala, 200 micras. <img alt="Figura 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Figura 11. Además del zoom-in de una porción de la mitad del cerebro se muestra en la Figura 9. Varios axones en la corteza pueden distinguirse claramente. La barra de escala, 50 micras.

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Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

En este artículo se describe el procedimiento experimental completo para reconstruir, con alta resolución, la anatomía del cerebro multa de cerebros de ratón marcados con fluorescencia. El protocolo descrito incluye la preparación de muestras y el desmonte, la muestra de montaje para imágenes, datos post-procesamiento y visualización multi-escala.

Micron escala Resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con Hoja confocal Microscopía de Luz

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

micron-scale-resolution-optical-tomography-entire-mouse-brains-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.5K vistas.  European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS).  En este artículo se describe el procedimiento experimental completo para reconstruir, con alta resolución, la anatomía del cerebro multa de cerebros de ratón marcados con fluorescencia. El protocolo descrito incluye la preparación de muestras y el desmonte, la muestra de montaje para imágenes, datos post-procesamiento y visualización multi-escala. 

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Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

Grabación óptica de la actividad neural suprathreshold con la resolución de una sola célula y único punta-

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Investigación

Neurociencias

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

Inmunotinción flotante de cerebros de ratón

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

Caracterización de uniones neuromusculares en ratones mediante microscopía combinada confocal y de superresolución

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Registro de transitorios de calcio en unión neuromuscular de ratón con alta resolución temporal mediante microscopía confocal

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Aplicación de espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS) para la mielinización de imágenes en cortes cerebrales

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imágenes unicelulares de todo el cerebro y análisis de cerebros de ratones neonatales intactos mediante resonancia magnética, limpieza de tejidos y microscopía de hoja de luz

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

Obtención de imágenes de la cóclea envejecida con microscopía de fluorescencia de lámina de luz

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Alineación de Fibergram OCT de Retina de Ratón con Imágenes Confocales

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Autor destacado: Avances en imágenes de retina in vivo y ex vivo para mejorar el diagnóstico y tratamiento del glaucoma 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Alineación de figramas de tomografía de coherencia óptica en luz visible con imágenes confocales de la misma retina de ratón

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...