Para empezar, transfecte las células del adenocarcinoma de estómago con TMEM200A siRNA e incube durante dos días. Luego, deseche el medio de cultivo celular de los pocillos y lave suavemente las células dos veces con un mililitro de PBS. Utilizando un kit de aislamiento de ARN, aísle el ARN total de las células.
Estime la concentración de ARN y sintetice ADNc con un microgramo de ARN utilizando un kit de síntesis de ADNc, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ahora configure la RTPCR cuantitativa en diluciones diez veces mayores de ADNc en una mezcla de reacción de 10 microlitros. Agregue cebadores y mezcla maestra de PCR cuantitativa utilizando el sistema de ensayo de PCR en tiempo real.
Utilice las condiciones cuantitativas de reacción de PCR que se muestran aquí y determine la expresión relativa de cada gen mediante la técnica de TC de doble delta. La línea celular HGC-27 sobreexpresó drásticamente TMEM200A proteína y transcripción de ARNm en comparación con la línea celular GES-1. La expresión diferencial del ARNm de TMEM200A en células de cáncer gástrico humano, SGC-7901, es mayor que en células GES-1.
