Disociación de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre embrionarias humanas y determinación óptima de la etapa de criopreservación

Para empezar, diluir un vial de matriz de membrana basal fría descongelada con 12 mililitros de DM EM F12. Mezclar bien la suspensión. Agregue un cubreobjetos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos.

A continuación, pipetee 250 microlitros de la solución de matriz diluida en cada pocillo. Deseche el medio de cultivo de las placas de células epiteliales de pigmento de retina derivadas de hESC cultivadas. Lave las placas dos veces con un mililitro de PBS precalentado por pocillo.

A continuación, agregue 0,5 mililitros del reactivo de disociación celular a los pocillos de las placas de cultivo e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos para iniciar la digestión. Después de la incubación, observe las células bajo el microscopio para confirmar el final de la digestión. Ahora, con una pipeta de un mililitro, pipetea suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo 10 veces.

Agregue medio de cultivo precalentado para diluir la suspensión. A continuación, centrifugar a 250 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Vierta el sobrenadante del tubo de la centrífuga.

A continuación, vuelva a suspender el pellet celular en dos mililitros del medio de cultivo. Use una pipeta para mezclar las células de 10 a 15 veces. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 micrómetros.

A continuación, cuenta las células epiteliales pigmentarias de la retina. Aspire la solución de recubrimiento antes de enchapar. Luego, agregue un mililitro del medio de cultivo en cada pocillo y siembre las células en los cubreobjetos.

Después de la incorporación y tinción de EDU, capture las imágenes de cinco campos aleatorios con un microscopio de fluorescencia. Calcule el porcentaje de células EDU positivas. A continuación, trace las curvas de proporcionalidad-tiempo correspondientes para generar una curva de crecimiento.

Por último, determine la ventana de congelación de la fase exponencial para cada línea celular. Las células epiteliales pigmentarias de la retina perdieron inicialmente su morfología hexagonal característica, pero posteriormente la recuperaron en la fase exponencial de crecimiento. Cuando las células se cultivaron durante una semana adicional, la proliferación celular disminuyó.

El ensayo de proliferación EDU confirmó que las células P2 del quinto día exhibieron una mayor tasa de proliferación, mientras que las células del día P2 11 habían entrado en la fase de desaceleración.