Este es un modelo para la enfermedad de la retina y emula la retina in vivo. Hasta cierto punto, podría reemplazar los experimentos con animales. El protocolo está optimizado para la calidad y cantidad de los precursores de fotorreceptores en los organoides de la retina, y el fotorreceptor es la clave para varias condiciones de ceguera irreversible.
Comience cultivando las células madre embrionarias humanas, o hESCs, en condiciones libres de alimentador. Para hacerlo, cubra un pocillo de una placa de seis pocillos con un mililitro de 100 microgramos por mililitro de reactivo A, e incube la placa a 37 grados centígrados durante al menos media hora. Descongele una alícuota de un millón de hESCs y centrifugarla a 200 xg durante cinco minutos.
Después de retirar el sobrenadante, siembre las células en la placa previamente recubierta, junto con dos mililitros de reactivo B.Pase las células después de alcanzar aproximadamente el 80% de confluencia alrededor de cuatro días. Después de alcanzar la confluencia, lave las células con DPBS precalentado y transfiéralas a 500 microlitros de reactivo recién preparado. Luego, incubar las células durante 3,5 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Separe las celdas moviendo el costado y la parte inferior de la placa durante unos segundos y agregue 500 microlitros de uno mediano preparado. Cosecha las células desprendidas en un nuevo tubo de 1,5 mililitros y pipeta la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo. Para el recuento celular, agregue 100 microlitros de suspensión celular a 900 microlitros de DPBS.
Diluir los 900 microlitros de la suspensión celular restante con uno mediano en la placa de Petri para lograr nueve veces 10 a la cuarta celdas de potencia por mililitro. Agregue 100 microlitros de suspensión celular diluida a cada pocillo de una placa no adherente, con fondo en V y de 96 pocillos. Gire ligeramente la placa en una agitadora de baja velocidad durante cinco minutos e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta el segundo día.
En el segundo día, agregue 20 microlitros de reactivo A al 1% a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y pipete dos veces en el centro para dispersar las células muertas. Limpie el fondo del plato antes de incubarlo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta el día seis. En el día seis, reemplace 58 microlitros del medio con 60 microlitros de medio fresco y continúe la incubación.
El día 12, cosecha los gránulos celulares de la placa de 96 pocillos en un tubo cónico de 15 mililitros, y deja que los gránulos se asienten naturalmente durante cinco minutos a temperatura ambiente. Cuando los gránulos se asienten, retire el sobrenadante sin alterar los organoides y transfiera los agregados celulares a un plato de suspensión de 10 centímetros que contenga 18 mililitros de medio dos con reactivo A.Incubar el plato a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta el día 18. El día 18, confirmar la generación de una vesícula óptica semitransparente en la placa, y cortar los organoides generados con un cuchillo microquirúrgico.
Agregue todos los pellets cortados al centro del plato. Luego, cosecha las células en un tubo cónico Falcon de 15 mililitros. Cuando las células se asienten, retire suavemente el sobrenadante y resuspenda los gránulos en dos placas de Petri de 10 centímetros con 18 mililitros de medio, tres por plato.
Transfiera suavemente los platos a la incubadora para evitar la agregación celular. Continuar cultivando las células, cambiando el medio semanalmente. Analizar la expresión de CRX desde el día 45 hasta el día 120.
En este análisis representativo, se muestran varias etapas de la generación de la retina humana. En el sexto día, los organoides aparecieron como un agregado de conexiones densas dentro de un borde brillante con un diámetro de alrededor de 600 micrómetros. El día 12, tuvo lugar la generación inicial de las estructuras en forma de vesícula óptica.
Los organoides sin una arquitectura adecuada similar a vesículas fueron descartados antes de cultivarse en una placa de Petri el día 18. Para el día 30 del cultivo, la arquitectura en forma de vesícula era más obvia, y las RO inferiores podían distinguirse y eliminarse fácilmente. A partir del día 45, los organoides expresaron varios marcadores de precursores de fotorreceptores, como CRX, RCVRN y OTX2.
Al escindir los organoides retinianos superiores, la eficiencia de diferenciación se mejora significativamente y se podrían cosechar más de 100 organoides superiores de 96 placas.
