Este método demuestra la transfección basada en electroporación de células epiteliales pigmentarias humanas primarias utilizando el Sistema de Transposones de la Bella Durmiente, una evidencia de expresión transgénica y secreción de proteínas. La combinación del sistema de transposón de la Bella Durmiente y la electroporación permite la transfección eficiente de las células epiteliales pigmentarias humanas primarias, así como la expresión transgénica estable y persistente y la secreción de proteínas. El objetivo general es establecer una terapia de adición génica basada en células para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina, que requiere una secreción estable y persistente de la proteína terapéuticamente activa.
Demostrando el procedimiento estarán Anne Freialdenhoven y Antje Schiefer, asistentes técnicos médicos del laboratorio. Para preparar el ADN plásmido para la electroporación primaria de células RPE humanas, use un espectrofotómetro de microvolumen para cuantificar el contenido de ADN plásmido y ajuste la concentración a 250 nanogramos por microlitro en 10 milimolares Tris-HCL. Mezcle un volumen de 250 nanogramos por microlitro de ADN plásmido transposasa SB100X con 16 volúmenes de 250 nanogramos por microlitro de ADN plásmido del factor de epitelio derivado del epitelio pigmentario.
Agregue dos microlitros de la mezcla de plasma resultante en un tubo de microcentrífuga estéril de bloqueo seguro de 1.5 mililitros en hielo y llene un tubo amortiguador con tres mililitros de tampón E. Luego inserte el tubo en la estación de pipetas hasta que se escuche un clic y ajuste el dispositivo de transfección a 1, 100 voltios, un ancho de pulso de 20 milisegundos y dos pulsos. Preparar las células para la electroporación. Primero, verifique la morfología de los cultivos celulares primarios de EPR mediante microscopía de contraste de fase para evaluar su crecimiento y confluencia.
Tratar las células con 500 microlitros de 0,05% de tripsina EDTA por pocillo durante siete a 15 minutos en la incubadora de cultivo celular. Cuando las células se hayan desprendido, recoger las células por centrifugación, resuspender las células en un mililitro de PBS y centrifugar de una a 10 veces 10 a las cuatro alícuotas celulares por reacción de transfección. Resuspender los pellets en 11 microlitros de tampón R por tubo y añadir dos microlitros de la mezcla de plásmidos preparada a cada tubo.
Inserte la cabeza de una pipeta de transfección en una punta de transfección de 10 microlitros hasta que la abrazadera recoja completamente el vástago de montaje del pistón y cargue la célula y la solución plásmida en la punta de transfección. Inserte la pipeta de transfección en el tubo tampón colocado dentro de la estación de pipetas hasta que se escuche un clic y pulse start para comenzar el proceso de electroporación. Después de la transfección, retire cuidadosamente la pipeta de transfección de la estación de pipetas e inmediatamente pipetear la célula y la solución plásmida en los pocillos preparados de la placa de cultivo celular.
Purificar sus proteínas de fusión de factores derivados del epitelio pigmentario marcadas a partir de sobrenadantes de cultivo celular RPE. Primero, use una punta de corte cónico para recolectar una alícuota de 30 microlitros de suspensión de níquel NTA por muestra y granular la resina de níquel NTA por centrifugación. Resuspenda cuidadosamente la resina NTA de níquel con 200 microlitros de tampón de incubación One X y granule la solución con una centrifugación adicional dos veces.
Después de la segunda centrifugación, resuspenda cuidadosamente los gránulos de resina NTA de níquel con 40 microlitros de tampón de incubación Four X por muestra. A continuación, mezcle 55 microlitros de una alícuota de lodo NTA de níquel pretratado con 260 microlitros de tampón de incubación Four X y 900 microlitros de cada sobrenadante de cultivo celular RPE transefcado. Incubar la mezcla en una coctelera a temperatura ambiente durante 60 minutos y granular las mezclas de resina NTA de níquel nuevamente.
Resuspenda cuidadosamente los gránulos en 175 microlitros de tampón de incubación One X y centrifugue las mezclas dos veces más. Después de la segunda centrifugación, resuspenda cuidadosamente los gránulos de resina NTA de níquel en 30 microlitros de tampón Elution durante una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente agitando y centrifugando las muestras nuevamente. Luego recoja cuidadosamente los sobrenadantes y mézclelos con un tampón de muestra Two X SDS para el análisis de sangre occidental de las proteínas purificadas.
Las células RPE primarias cultivadas aisladas de ojos de donantes humanos demuestran una morfología típica de adoquines independientemente de la edad del donante, el tiempo postmortem de aislamiento o el tiempo de cultivo. La aplicación de pulsos eléctricos a corto plazo a las células humanas primarias del EPR. El uso del sistema de transfección capilar no afecta negativamente a la morfología epitelial.
El análisis de sangre occidental de sobrenadantes de cultivo de células RPE humanas primarias transfectadas demuestra la secreción de factor derivado del epitelio pigmentario a niveles consistentes sin silenciamiento transgénico durante más de 500 días. Como se observa en este análisis de sangre occidental representativo del medio de cultivo celular de transfecciones realizadas en serie, se observa una tasa de secreción de factor derivado del epitelio pigmentario universalmente más alta a los 21 días después de la transfección. En un cultivo perseguido, la secreción elevada de PEDF a largo plazo dura al menos 165 días.
Además, la cuantificación basada en ELISA revela un aumento de 20 veces de la secreción total del factor derivado del epitelio pigmentario en las células RPE humanas primarias transfectadas en comparación con las respectivas células de control no transfectadas. Este incremento también se afirmó en el nivel de expresión génica en el que la expresión total de PEDF se elevó más de 30 veces. Al intentar este protocolo, es importante utilizar células epiteliales pigmentarias cuya morfología corresponda al estado In Vivo.
Además, recuerde extraer la solución celular en la punta de transfección sin burbujas de aire. Las células transfectadas de manera estable se pueden usar en diferentes modelos Ex Vivo o In vivo para verificar la funcionalidad de esta terapia de adición génica basada en células.
