Para empezar, retira el tejido de los huesos del ratón diseccionado con eutanasia. Coloque los huesos limpios en una nueva placa de seis pocillos que contenga tampón FACS colocado en hielo. Transfiera los huesos a un mortero con dos a cinco mililitros de tampón FACS.
Muele los huesos con movimientos circulares hasta que se libere la médula ósea. Con una jeringa de tres mililitros, tire hacia arriba y hacia abajo de la médula ósea para homogeneizarla. Coloque el homogeneizado en otra jeringa, luego fíltrelo a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros.
Enjuague los trozos de tejido de su filtro nuevamente en el mortero con tampón FACS antes de homogeneizar por segunda vez. Filtre el pañuelo enjuagado como antes. A continuación, enjuague las espículas óseas restantes nuevamente en el mortero con tampón FACS.
A continuación, enjuague las piezas en un tubo de 15 mililitros para garantizar el máximo rendimiento. Para digerir la médula ósea, primero centrifugarla a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender el gránulo de médula ósea en dos mililitros de mezcla de digestión.
Transfiere la mezcla a un tubo de 15 mililitros. Luego incubarlo a 37 grados centígrados durante 45 minutos en un rotador. Ahora, agregue 10 mililitros de tampón FACS para detener la digestión enzimática.
Filtre la mezcla a través de un colador de celdas de 70 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar la suspensión a 400 G durante siete minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos.
A continuación, agregue 10 mililitros de tampón FACS para detener la lisis. Luego filtre la mezcla como antes en un tubo de 50 mililitros. Por último, centrifugar la mezcla a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en 100 microlitros de tampón FACS. Para la digestión de las espículas óseas, primero, vórtice las espículas óseas. Decantar el sobrenadante y conservar los huesos en la parte inferior.
A continuación, vuelva a suspender las espículas en un mililitro de la mezcla de digestión de la espícula ósea. Incubar el tubo en un rotador durante 60 minutos a 37 grados centígrados. Finalmente, detenga la digestión con 10 mililitros de tampón FACS.
Filtre la mezcla en el tubo de 50 mililitros que contiene la médula ósea lisada y digerida por glóbulos rojos.
